Carlos Sinogas - Biotecnologia 2014/15

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2 Terapia genética Técnica para corrigir efeitos de genes responsáveis por patologias Métodos Inserção de gene normal para substituição de gene não funcional Correcção do gene anormal (mutações especí?icas, recombinação homóloga) Regulação da expressão de produto disfuncional

3 Doenças genéticas São doenças causadas por anomalias no material genético do indivíduo afectado (alterações na sequência normal do genoma) A thousand ills require a thousand cures Ovid (43 B.C.)

4 Tratamentos de doenças genéticas Dietas especiais Suplemento com metabolito não sintetizado Inibição de reacções enzimáticas Prevenção da acumulação de componentes tóxicos Remoção de moléculas tóxicas Diálise, excreção facilitada Substituição de produto defeituoso ou em falta Terapêutica de substituição de proteína ou enzima Alteração de proteína defeituosa por pequenas moléculas Indução da hidrólise da proteína defeituosa Transplantação de órgãos Substituição de órgão não funcional

5 Tratamentos de doenças genéticas Terapia genética Recti?icação de defeito genético com o gene funcional Terapia de ácidos nucleicos Bloqueio de tradução de mrna de gene defeituoso (ribozima, antisenso, sirna)

6 Tipos de doenças genéticas Monogénica Patologia resultante de alterações ou mutações na sequência de um único gene. Multifactorial (complexas, poligénicas) Patologia resultante da combinação de múltiplos factores ambientais e mutações em diversos genes. Cromosomal Anomalias cromosomais (S. Down) Mitocondrial Patologia por mutações no genoma da mitocôndria

7 Objectivo dos tratamentos Corrigir fenótipo patológico / anormal Seleccionar substratos Intolerância à lactose Substituir proteínas Factor IX (hemo?ilia) circulante Enzimas lisosomais intracelular Substituir genes Corrigir funcionamento de genes

8 Primeiro passo Identi?icar o problema Conhecer o sistema Via metabólica (metabolitos) Componentes intervenientes Funcionamento do sistema Ao nível do órgão Ao nível celular Característica dominante Característica recessiva

9 Avanços técnico- cientí;icos Conhecimentos cientí?icos Estrutura do DNA Funcionamento molecular das células Factores etiológicos de patologias Sequência do genoma humano... Desenvolvimento tecnológico Clonagens moleculares (enzimas de restrição, polimerases, ligases,...) Sequenciação de DNAs Manipulação de células e virus Informática...

10 Terapia genética humana (sentido estrito) Administração de ácido nucleico a célula somática para corrigir situação debilitante, aliviar sofrimento ou aumentar longevidade Não altera a linha germinal Alterações genéticas não passam à descendência

11 Hemo;ilia Falta de factor da coagulação Terapêutica convencional Injecção i.v. do factor em falta Terapia genética Introdução de gene do factor em célula que o segregue para a circulação Que célula? Quantas células? Quando?

12 Mucopolissacaridose Falta de enzima lisosomal Terapêutica convencional Injecção i.v. da enzima em falta. Endocitose celular Terapia genética Introdução de gene da enzima em célula que o segregue para a circulação. Endocitose celular Que célula? Quantas células? Quando?

13 Fibrose quística Falta de receptor transmembranar nas vias aéreas Terapêutica convencional... (processamento da proteína no Golgi) Terapia genética Introdução de gene do receptor nas células apropriadas Que célula? Quantas células? Quando?

14 Depois do gene... Como chegar à célula alvo para introduzir o gene? ex vivo vs. in vivo Que percentagem de células alvo precisa ser alterada? Para resolver clinicamente a situação Quais as consequências de uma eventual expressão incorreta? Insu?iciente / Excessiva Qual a duração do gene nas células alvo? Células somáticas, renováveis A expressão do gene é constitutiva ou regulada? Elementos estruturais ou funcionais Se expressão modulada, como regular? Ribozimas / Antisenso / sirna

15 Como injectar o DNA na célula alvo? Injecção in situ (DNA puri?icado) DNA em liposomas e/ou associado a ligandos especí?icos da célula alvo Vectores virais Retrovirus (células sanguíneas) Adenovirus (trato respiratório) Virus associados aos adenovirus (AAV) Herpesvirus (células nervosas)...

16 Riscos associados à terapia genética Inserção em local inapropriado Disrupção de gene em expressão normal Patologia nova Indução de expressão de oncogene (repressão de inibidor) Indução de tumor Vectores virais Ativação ou complementação de provírus ou de retro- elementos Infecção viral / tumor Reversão da infeciosidade do vector Infecção viral

17 in- vivo / ex- vivo

18 Células estaminais hematopoiéticas

19 Limitações actuais da terapia genética Doenças multigénicas ou multifactoriais Vida curta do DNA e das células recombinadas ( terapêutica continuada) Resposta imunitária a componentes estranhos ( impede terapêutica continuada) Precisão do local de inserção do gene Falta de controlo de gene dosage

20 Contratempos Vida curta do DNA e das células recombinadas ( terapêutica continuada) Resposta imunitária a componentes estranhos ( impede terapêutica continuada) Precisão do local de inserção do gene Gelsinger (18 anos) falta de enzima hepática (OTC); alta concentração de DNA injectado (1% no?ígado); activação da imunidade inata; morte em 4 dias (USA) 2002/2003 X- SCID (2 crianças) ADA em vector retroviral; desenvolvimento de leucémias (França)

21 Ensaios clínicos, exemplos

22 Questões éticas O que é normal e anormal? O que é doença ou inaptidão? É legitimo aumentar a vida de incapacitados e viabilizar a sua procriação? Se somática, porque não germinal? Quem pode ou deve aceder? QUEM DECIDE? QUEM PAGA?

23 Epílogo In our view, gene therapy may ameliorate some human genetic diseases in the future... T. Friedmann, Science, 1972

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