Tecnologia do DNA Recombinante-TDR

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1 Tecnologia do DNA Recombinante-TDR (clonagem de DNA) CONSTRUINDO A MOLÉCULA DE DNA RECOMBINANTE,

2 BIOTECNOLOGIA:Engenharia genética. A utilização de microorganismos, plantas e animais para a produção de substâncias úteis ao ser humano é chamada de biotecnologia. A engenharia genética é uma nova biotecnologia baseada nas técnicas modernas de manipulação do DNA, que permite transplantar genes de uma espécie para outra e criar uma nova molécula de DNA que não exista na natureza.

3 Histórico Stanley Cohen e Herbert Boyer fizeram o primeiro experimento de engenharia genética em Eles demonstraram que o gene para o RNA ribossomal de um sapo (eucarionte) podia ser transferido para uma bactéria (procarionte) que o expressava. Xenopus laevis. rdna (DNA recombinante)

4 DNA Recombinante São moléculas de DNA que contêm fragmentos de DNA ligados covalentemente, derivados de duas ou mais fontes, geralmente espécies diferentes. A técnica central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem molecular. A origem do termo clonagem vem da genética bacteriana que considera uma colônia de bactéria como um clone porque todos os indivíduos são geneticamente idênticos à bactéria inicial.

5 Aplicação da Tecnologia do DNA recombinante A Tecnologia do DNA recombinante tem uma ampla aplicação. Pode ser usada para: -produzir substâncias úteis: insulina humana, hormônio de crescimento,vacinas, enzimas industriais em grandes quantidades, estudar mecanismos de replicação e expressão gênica, etc; -investigação de paternidade; -diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas; -terapia gênica; -transgênicos;

6 Sintetizar compostos úteis

7 ETAPAS PARA FORMAÇÃO DE UM DNA RECOMBINANTE Enzima de restrição GERAÇÃO DE FRAGMENTOS DE DNA Ligase JUNÇÃO COM UM VETOR OU UMA MOLÉCULA CARREADORA Transformação: Eletroporação ou CaCl 2 INTRODUÇÃO EM UMA CÉLULA HOSPEDEIRA Resistência a antibióticos ou algum outro marcador SELEÇÃO OBTENÇÃO DO DNA RECOMBINANTE

8 Enzimas de restrição

9

10 Extremidade cega:

11 Enzimas de restrição Extremidades: PROTUBERANTES

12 Iso-esquisômero

13 Melhor opção para a clonagem?

14 I hope DNA Ligase em Ação!

15 T4 DNA Ligase

16 Escolhendo o Vetor Tamanho do DNA a ser clonado? Produção de Proteína? Em célula procariótica ou eucariótica?

17 Tipos de Vetores e tamanho dos insertos Para diferentes tamanhos de DNA: plasmideos: até 5 kb Vetor de fago lambda (λ) : até 50 kb BAC (bacterial artificial chromosome): 300 kb YAC (yeast artificial chromosome): 2000 kb Vetores de Expression : fazem RNA e proteina a partir do DNA inserido shuttle vectors: podem crescer em duas espécies diferentes

18 Características de um Vetor de expressão

19 Características de um Plasmídeo MCS

20 Bula puc19

21 Tipos de Vetores -Vetor de fago lambda (λ) BAC (bacterial artificial chromosome): 300 kb YAC (yeast artificial chromosome): 2000 kb Vetores de Expression : fazem RNA e proteina a partir do DNA inserido

22 Vetor de fago lambda (λ) : até 50 kb Uns dos vetores mais usados nos processos de clonagem molecular é o denominado bacteriófago λ, comporta-se como um vírus de E.coli. O fago λ ao infectar a bactéria E.coli pode seguir 2 vias: - ciclo lítico; - ciclo lisogênico;

23 O fago como vetor de clonagem Durante o ciclo lítico, os genes envolvidos na lisogenia podem ser substituídos por outro framento de DNA (inserto de interesse), sem que haja qualquer alteração na via lítica. Este processo é altamente eficiente quando comparado com a transformação bacteria usando plasmídeo.

24 O fago como vetor de clonagem

25 Tipos de Vetores BAC (bacterial artificial chromosome): 300 kb YAC (yeast artificial chromosome): 2000 kb Vetores de Expression : fazem RNA e proteina a partir do DNA inserido

26 Bacterial Artificial Chromosomes Based on the F plasmid that confers the ability to conjugate. Low copy number plasmids (usually 1 per cell), which prevents crossing over between repeated sequences in the insert DNA But, low copy number also means low DNA yield. Transformed into E. coli using electroporation, subjecting the bacteria to a high voltage electrical field. BACs are currently the most common vector for large inserts such as eukaryotic genome projects.

27 Tipos de Vetores YAC (yeast artificial chromosome): 2000 kb Vetores de Expression : fazem RNA e proteina a partir do DNA inserido

28 Yeast Artificial Chromosomes A linear chromosome, has centromere, telomeres, ARS (autonomously replicating sequence), selectable marker for yeast (uracil or tryptophan biosynthesis genes usually). Also has E. coli ori and selectable marker: you can grow the vector itself in E. coli Then purify it, ligate in foreign DNA, transform into yeast.

29 Tranformação ou transfecção? Tranformação Bactérias CaCl 2 (bactéria competente) e Eletroporação Transfecção Eucariontes Lipofectamina

30 Tranformação Bactérias

31 Isolamento e amplificação dos plasmídeos recombinantes Seleção: Antibióticos, colonias brancas ou azuis (LacZ, IPTG, X-gal),

32 Seleção

33 Marcadores de Seleção:

34 Marcadores de Seleção:

35 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

36 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

37 Para checar a clonagem: POR RESTRIÇÃO: PCR: SEQUENCIAMENTO:

DNA r ecomb m i b n i a n nt n e

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