Tecnologia do DNA recombinante. John Wiley & Sons, Inc.

Transcrição

1 Tecnologia do DNA recombinante John Wiley & Sons, Inc.

2 Tópicos Técnicas básicas usadas para identificar, amplificar e clonar genes Construção e triagem de bibliotecas de DNA Análise molecular de DNA, RNA e proteína Análise molecular de genes e cromossomos

3 Pontos Essenciais Os organismos transgênicos são criados pelo aproveitamento dos vetores biológicos. Os fenótipos dos organismos transgênicos podem fornecer informações sobre a função gênica. As técnicas de genética reversa começam com uma sequência gênica. A tecnologia de DNA recombinante nos seres humanos é uma via para o desenvolvimento da terapia gênica. A clonagem de plantas e animais produz indivíduos geneticamente idênticos.

4 A introdução de genes estranhos nos genomas cria organismos transgênicos O gene introduzido é conhecido como transgene; se o gene introduzido vier de uma espécie diferente, ele é um transgene heterólogo. Os dois principais desafios na criação de um organismo transgênico são a necessidade de: 1. introduzir DNA em uma célula de tal modo que esse DNA se integre ao genoma e 2. fornecer as sequências regulatórias adequadas para que o transgene venha a ser expresso convenientemente.

5 Técnicas básicas usadas para identificar, amplificar e clonar genes DNA Recombinante, clonagem gênica e técnicas de amplificação de DNA permitem isolar e caracterizar qualquer sequência de DNA de qualquer organismo.

6 Clonagem gênica Clonagem gênica é o isolamento e amplificação de um determinado gene. Uma molécula de DNA recombinante é uma molécula de DNA feita pela junção de uma ou mais moléculas diferentes de DNA.

7 Amplificação de um Gene In Vivo Um minicromossomo carregando o gene de interesse é produzido em um tubo. O minicromossomo recombinante é introduzido na célula hospedeira (ex. E. coli) e a célula hospedeira replica o minicromossomo.

8 Amplificação de um Gene In Vitro Pequenas sequências de DNA complementares à sequência de DNA em ambos os lados do gene interesse são sintetizadas. Essas curtas sequências de DNA são usadas para iniciar a amplificação de um gene usando DNA polimerase (PCR).

9 Como amplificar um gene de interesse

10 Enzimas de Restrição

11 John Wiley & Sons, Inc.

12 Estructura do complexo EcoRI-DNA John Wiley & Sons, Inc.

13 Muitas enzimas de restrição geram contas colantes John Wiley & Sons, Inc.

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15 Como funciona a amplificação

16 Estrutura de dois plasmídeos

17 John Wiley & Sons, Inc.

18 Vetores Plasmidiais Circular, dupla fita de DNA, presentes em bactérias. De 1 kb a 200 kb. Replicação autônoma. Genes de resistência à antibióticos, que podem ser usados como marcadores de seleção. John Wiley & Sons, Inc.

19 Vetores: Bacteriófagos Um terço (cerca de 15 kb) do cromossomo do bacteriófago contém genes necessários para lisogenia. Essa porção pode ser removida e substituída por DNA exógeno. John Wiley & Sons, Inc.

20 Clonagem usando o fago como vetor

21 Vetores: Cosmídeos Híbridos entre plasmídeos e o fage. Replicação autônoma em E. coli. Capacidade de empacotamento do fago. Aceita insertos de kb. John Wiley & Sons, Inc.

22 Uso do Xgal para identificar colônias O gene de E. coli lacz codifica -galactosidase. -galactosidase converte o substrato incolor Xgal em um produto azul. Células com atividade de -galactosidase produzem colônias azuis em presença de Xgal; caso contrário, as colônias são brancas. John Wiley & Sons, Inc.

23 Vetores Eucarióticos Diferentes organismos usam diferentes origens de replicação e sinais regulatórios, por isso, diferentes vetores de clonagem precisam ser usados para diferentes espécies. Vetores de clonagem especiais podem replicar tanto em procariotos como em eucariotos. John Wiley & Sons, Inc.

24 Vetores Shuttle podem replicar em E. coli e em outras espécies John Wiley & Sons, Inc.

25 Yeast Artificial Chromosomes (YACs) Mini cromossomos de leveduras geneticamente modificados. Aceita insertos de DNA exógeno de kb. Contém uma origem de replicação de levedura, centrômero de levedura, dois telômeros de levedura, um marcador selecionável e um local de policlonagem. John Wiley & Sons, Inc.

26 BACs e PACs Cromossomos artificiais bacterianos (BACs) foram construídos a partir de fatores de fertilidade bacteriana (F) Cromossomos artificiais P1 (PACs) foram construídos a partir de cromossomos P1 de bacteriofagos. BACs e PACs aceitam insertos de kb e são menos complexos que os YACs. John Wiley & Sons, Inc.

27 Estrutura de um cromossomo artificial bacteriano (BAC) usado para clonar grandes fragmentos de DNA (150 a 300kb)

28 PCR Reação em Cadeia da Polimerase Inventada em 1983 por Kary Mullis é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas Kary Mullis ganhou o prêmio Nobel em 1993 pela invenção da PCR.

29 PCR Reação de PCR: DNA dntps (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) iniciadores (também chamados de primers) DNA polimerase solução tampão

30 PCR Toda esta mistura é colocada na máquina de PCR, o termociclador, que faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos

31 Desnaturação Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de DNA por meio da elevação da temperatura. As amostras são aquecidas a ºC durante um a vários minutos.

32 Hibridação A temperatura é reduzida a ºC durante alguns segundos. Os iniciadores hibridam com as sequências complementares do DNA molde

33 Extensão Eleva-se a temperatura a 72ºC por alguns segundos. A DNA polimerase faz a duplicação da cadeia a partir dos iniciadores

34 John Wiley & Sons, Inc.

35 John Wiley & Sons, Inc.

36 John Wiley & Sons, Inc.

37 Pontos essenciais A descoberta das enzimas de restrição que clivam o DNA em sequências específicas permitiu a produção de moléculas de DNA recombinante in vitro. Sequências de DNA podem ser inseridas em vetores e amplificadas por replicação in vivo.

38 Pontos essenciais A reação em cadeia da polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar uma sequência específica de DNA in vitro.

39 Construção e triagem de bibliotecas de DNA

40 Bibliotecas de DNA Uma biblioteca de DNA genômico é um conjunto de clones de DNA, que coletivamente contem o genoma inteiro de um organismo. Uma biblioteca de cdna contem as regiões codificadoras dos genes expressos de um organismo.

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43 Síntese de cdnas a partir de mrna

44 Uso de sondas para identificar o clone portador do gene de interesse

45 Técnica de andar no cromossomo

46 Encontrando o clone de interesse usando anticorpo em uma biblioteca de expressão

47 Análise Molecular de DNA, RNA e Proteína DNA, RNA ou proteínas podem ser separadas por eletroforese, transferidas para membranas e analisadas por vários procedimentos.

48 Análises de DNA por Hibridização Southern Blot

49 O DNA genômico digerido por enzimas de restrição produz muitos fragmentos e forma um contínuo. Uma sonda pode identificar uma banda específica: técnica de Southern blot

50 Southern Blot: John Wiley & Sons, Inc.

51 Identificação de um fragmento específico por Southern Blot John Wiley & Sons, Inc.

52 Análises de RNAs por Northern Blot O Northern Blot é semelhante ao Southern blot, exceto: RNA é sensível a degradação por RNases;. moléculas de RNA contem estruturas secundárias e tem que ser desnaturadas. Northern blot é útil para estudos de expressão gênica.

53 Northern Blot (RNA de raiz, folhas e flores de A. thaliana) John Wiley & Sons, Inc.

54 Análise de RNAs por Transcriptase Reversa -PCR (RT-PCR) John Wiley & Sons, Inc.

55 Análise de Proteínas por Western Blot Polipeptídeos são separados por eletroforese em gel de poliacrilamida. Proteínas são transferidas do gel para a membrana de nitrocelulose. Proteínas individuais são detectadas com anticorpos.

56 Análise Molecular de Genes e Cromossomos Os sítios das enzimas de restrição podem ser usados para construir mapas

57 Mapeamento por enzimas de restrição John Wiley & Sons, Inc.

58 Sequenciamento de DNA

59 2',3'-Dideoxyribonucleoside Triphosphates John Wiley & Sons, Inc.

60 Sequenciamento de DNA : método de Sanger John Wiley & Sons, Inc.

61 John Wiley & Sons, Inc.

62 John Wiley & Sons, Inc.

63 John Wiley & Sons, Inc.

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