MARCADORES MOLECULARES: AFLP E RFLP

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1 Universidade Federal de Pelotas Programa de Pós Graduação em Agronomia Disciplina de Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento MARCADORES MOLECULARES: AFLP E RFLP Prof. PhD. Antonio Costa de Oliveira Gabriela Lemos Mendes Doutoranda PPG Biotecnologia Pelotas, abril de 2015

2 Produção agrícola/agropecuária Variedades com desempenho superior Seleção com base no fenótipo Seleção de indivíduos superiores com base no genótipo Alta produtividade e qualidade MARCADORES MOLECULARES

3 Melhoramento Convencional Seleção Fenotípica P 1 x P 2 F 1 F 2 Estresses abióticos e bióticos

4 Com o advento das técnicas de biologia molecular, surgiram metodologias alternativas para detectar o polimorfismo diretamente ao nível de DNA.

5 MARCADORES MOLECULARES Fragmentos de DNA associados/responsáveis por uma característica genética, apresentando uma variação detectável entre indivíduos da população testada (marcador genético) São sequências de DNA que revelam polimorfismos entre indivíduos geneticamente relacionados Um marcador genético ideal deve apresentar uma série de atributos: Alto nível de polimorfismo Herança codominante Estabilidade em diferentes ambientes Distribuídos em todo genoma

6 APLICAÇÕES DOS MARCADORES MOLECULARES Genotipagem de organismos Detecção variabilidade genética Seleção assistida por marcadores Proteção de cultivares Mapas genéticos

7 Bioquímicos Isoenzimas Hibridização RFLP VNTR Enzimas de Restrição RFLP AFLP PCR AFLP SSR RAPD SCAR

8 Etapas da tecnologia dos Marcadores moleculares Extração de DNA Corte do DNA com Enzimas de Restrição Separação por Eletroforese dos frag cortados Transferência dos frag DNA para membrana Obtenção e tratamento de Sondas Hibridização da sonda na membrana Exposição da membrana a filme de Raio X Ligação de adaptadores Obtenção/ desenvolvimento primers Amplificação via PCR Separação dos fragmentos amplificados Visualização dos fragmentos em gel agarose Visualização dos fragmentos em gel poliacril. Hibridização Amplificação RFLP/ VNTR RAPD SCAR SSR AFLP Tempo para resultados Etapa necessária Etapa não necessária

9 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

10 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Endonuclease que cliva a dupla fita de DNA sempre que identificar uma sequência particular de nucleotídeos que seja o sítio de reconhecimento da enzima Classificação com base na estrutura, atividade e sítios de reconhecimento I e III são menos atraentes para biologia molecular II: Proteínas monoméricas e diméricas e clivam o DNA dentro do sítio de reconhecimento Mecanismo de defesa de bactérias contra bacteriófagos

11 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

12 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Sítio específico de clivagem: 4 a 8 pb

13 Enzimas Organismo Sequência de reconhecimento Tipo de extremidade EcoRI Escherichia coli GAATTC Coesiva BamHI Bacillus amyloliquefaciens GGATCC Coesiva PvuI Proteus vulgaris CGATCG Coesiva PvuII Proteus vulgaris CAGCTG Cega HindIII Haemophilus influenzae AAGCTT Coesiva AluI Arthrobacter luteus AGCT Cega NotI Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC Coesiva SfiI Streptomyces fimbriatus GGCCNNNNGGCC Coesiva A sequência mostrada corresponde à de uma das fitas, representada na direção 5 para 3. As sequências de reconhecimento são palíndromos: quando as duas fitas são consideradas, elas são lidas da mesma maneira em ambas as direções.

14 AMPLIFICAÇÃO DNA

15 PCR- Reação em Cadeia da Polimerase Amplificação do DNA ou cdna in vitro Kary Mullis Prêmio Nobel de Química 1985 Primeiras publicações utilizando a técnica Componentes da reação: Água: diluente. dntp: A,T,C e G. Taq DNA polimerase: Thermus aquaticus (117 C / t ótima: 72 C) MgCl 2 Tampão Primers: correspondentes ao gene de interesse. DNA Molde: referente a amostra que se deseja estudar. Kary Mullis

16 PCR- Reação em Cadeia da Polimerase ETAPAS DA REAÇÃO Melting (desnaturação): Separação da dupla fita do DNA a ser amplificado Annealing (anelamento ou hibridização) : Primer + DNA a ser amplificado Extension (extensão): Polimerização da cadeia de DNA

17 Etapas da reação de PCR

18 HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

19 Hibridização de ácidos nucléicos Formação de um duplex (dupla fita estável) entre moléculas de fita simples complementares; DNA/DNA (Southern Blot) DNA/RNA (Northern Blot) RNA/RNA (Western Blot) Molécula alvo + Sonda (DNA de fita simples complementar à molécula alvo, conjugada a um repórter) RNA t Sonda quente: Radioatividade 32 P Sonda fria: Fluorescência digoxigenina ou fluoresceína

20 Hibridização de ácidos nucléicos Visualização da sequência de interesse molécula repórter emite um sinal (cor ou radiação) que poderá ser capturado; Processo de hibridização é influenciado por: N bases da molécula alvo e conteúdo GC Tempo / Temperatura Especificidade da hibridização Temperatura: t especificidade Tampão: Presença de sais favorece a hibridização cargas são neutralizadas

21 Hibridização de ácidos nucléicos Vídeo

22 MARCADORES MOLECULARES

23 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição Enzimas de restrição Hibridização de Ácido Nucléicos

24 RFLP Digestão do DNA genômico com ER Separação dos fragmentos gerados por eletroforese Transferência dos fragmentos desnaturados para suporte sólido Hibridização e visualização mediante autoradiografia

25 RFLP

26 RFLP Polimorfismos gerados Variação na sequência de nt Perdas, inserções ou substituições de sequencias de nt Alterações dos sítios de ER Detectado por diferenças no peso molecular dos fragmentos gerados

27 RFLP Expressão co-dominante Elevado n distribuídos ao longo do genoma Alta reprodutibilidade Avaliação em qualquer estádio de desenvolvimento Protocolo extenso Mão de obra especializada Grande quantidade de DNA Construção de sonda Estrutura adequada de laboratório

28 RFLP APLICAÇÕES

29 RFLP

30 RFLP

31 AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados Amplificação de DNA via PCR para detectar diferenças e um conjunto de fragmentos selecionados e digeridos com enzimas de restrição

32 AFLP Digestão TOTAL DNA genômico com 2 ER Ligação de adaptadores Pré- amplificação e amplificação seletiva via PCR Visualização em gel em poliacrilamina

33 AFLP

34 AFLP Vídeo

35 AFLP Grande número de fragmentos Amostragem ampla e simultânea do genoma Flexibilidade Detecção de variabilidade genética (polimorfismo) Não requer informação prévia de sequência de DNA Alta reprodutibilidade Marcadores dominantes Mão-de-obra especializada Pureza do DNA genômico

36 AFLP APLICAÇÕES

37 AFLP

38 AFLP

39

40 OBRIGADA

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