Introdução a Bioinformática Curso de Verão Nivelamento na área de Biológicas

Transcrição

1 Introdução a Bioinformática Curso de Verão 2011 Nivelamento na área de Biológicas 1

2 O que é genoma? Um genoma é o DNA completo de um organismo, incluindo os genes. Os genes levam a informação para produzir todas as proteínas necessárias para todos os organismos. Estas proteínas determinam como um organismo se parece, como pode ser seu crescimento e desenvolvimento, se defender de infecções e doenças, e possivelmente sobre seu comportamento. A molécula do DNA é composta por 4 bases: Adenina (A), Timina (T), Citosina (C) e Guanina (G). Estas bases são repetidas muitas vezes no genoma. A ordem dos As, Ts, Cs e Gs é crítico. A ordem destas letras determinam se um organismo é um humano ou de outra espécie como rato, chipanzé, etc. Esta é a razão estão muito interessados no seqüênciamento de genomas. Comparar DNA de outros organismos com o humano e entender a seqüência, irá ajudar os pesquisadores a aprender mais 2 sobre evolução e a vida humana.

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4 Célula procariota (bactérias) 4

5 Células Eucarióticas célula animal célula vegetal 5

6 Genoma (DNA) Gene (informação genética) transcrição RNAm tradução Proteína (função) 6

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8 1953 Abril de 1953: James Watson e Francis Crick descobrem a estrutura de dupla hélice do DNA

9 Nucleotídeos Base nitrogenada + Pentose + Fosfato 9

10 Ligação Fosfodiester Polaridade 5 -> 3 ph 7 = fosfatos c/ carga negativa neutralizados por interações iônicas com ptn, ions, poliaminas 10

11 Nucleotídeos Base nitrogenadas Pirimidina: Timina (T), Uracil (U) e Citosina (C) Purina: Adenina (A) e Guanina (G) 11

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13 Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos DNA: Armazenamento da informacão genética estabilidade RNA: várias funções RNA ribossomal (rrna) - componentes estruturais de ribossomos RNA mensageiro (mrna) - intermediário RNA transferência (trna) - moléculas adaptadoras que traduzem informação do mrna em aminoácidos snrna, microrna, etc 13

14 Organização dos genomas dos Procariotos e dos Eucariotos 14

15 A molécula do DNA está organizada em estruturas chamadas CROMOSSOMOS. Bactérias e vírus = um único cromossomo Organismos eucariotos = muitos cromossomos ex: Levedura possui 16 milho possui 20 humanos possui 46 O tamanho da molécula do DNA é freqüentemente muito maior que o compartimento que a contém. Assim, o empacotamento do DNA no cromossomo. precisa ser precisamente organizado 15

16 O superenrolamento do DNA é importante para compactar o DNA e assim caber dentro da célula. Isto implica em um alto grau de organização estrutural para permitir acesso da informação contida no DNA para os processos de replicação e transcrição. 16

17 Cromatina = DNA + proteína ( histonas e não-histônicas) Estrutura de um nucleossomo (150 a 250 pb de DNA associados a 2 cópias das proteínas chamadas de histonas (H2A, H2B, H3 e H4) e uma histona H1 externa 17

18 Compactação dos nucleossomos Microscopia eletrônica da estrutura Representação esquemática do DNA cromossomico preso a um scaffold nuclear. Cada dobra representa mais uma compactação. Dentro dos loops estão genes com funções relacionadas. 18

19 Dogma Central da Genética 19

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22 Replicação do DNA 22

23 Fragmento de Okazaki: Procariotos: 1000 e 2000 nt Eucariotos: 100 e 200 nt 23

24 Transcrição A fita de DNA que direciona a síntese da molécula de mrna complementar é chamada de fita molde ou codificadora ou fita antisenso. A transcrição ocorre no núcleo!!!! 24

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27 Splicing Alternativo 27

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29 Síntese de Proteínas 29

30 Síntese de Proteína: 30

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35 Dobramento da Proteína 35

36 Seqüênciamento de DNA Foi desenvolvido após o conhecimento de poder separar os fragmentos de DNA por tamanho O método de seqüênciamento de DNA de Sanger: ddntp 36

37 ELETROFORESE 37

38 PCR : Reação de Polimerase em Cadeia Tem a importância de produzir muitas cópias de um Fragmento de DNA Até 1980 o único método para produzir grandes quantidades de DNA era inserindo fragmentos de DNA em bactérias e selecionar aquelas contendo o fragmento isolados de muitas colônias crescendo numa placa. 1985: Kary Mullis, desenvolveu a técnica do PCR. 38

39 Em 1985 Mullis desenvolveu o método de PCR. 39

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42 Sequenciamento de DNA Automático Manual

43 Estratégias de Sequênciamento Completo de Genomas Procariotos 43

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45 Estratégias de Seqüenciamento Completo (Shotgun de DNA Genômico) DNA genômico ATGGGCCTTTG CTTTGCCCCCAAA TGCCCCCAAAAGGGGG AAAGGGGGAAAAG 50 kb ATGGGCCTTTGCCCCCAAAAGGGGGAAAAG 50 kb Seqüenciamento Gaps completo 1 a 2 kb 1 a 2 kb CCTGGGTTAGCTGCCTTTGC CTTTGCGGGTACGCCGGGGGAAAAG GGGAAAAGGGTACGCCGGGG 45

46 Estratégias de Sequenciamento: Genômico direto - biblioteca em cosmídeos - insertos de ~40kb randômico - bibliotecas em plasmídeos insertos entre 1-4kb biblioteca em fagos - insertos de ~20kb produtos de PCR digestão eletrônica x digestão em gel PCR

47 Expressed Sequence Tags (EST) cana de açúcar, arroz, eucalipto, humano, etc 47

48 Transcriptoma: Estudo de seqüências expressas (EST) Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 DNA extra gênico Síntese de RNA RNA primário Processamento RNAm

49 Bibliotecas de cdna DNA RNA cdna Proteína cdna: ATGTACGGGCTAC-TTTTTTT RNA: ATGTACGGGCTAC-AAAAAA 49

50 3. Síntese de cdna RNA m AAAAAA TTTTTT Not I Síntese da Primeira fita AAAAAA TTTTTT Not I Síntese da Segunda fita AAAAAA TTTTTT Not I Adição do Adaptador SalI Sal I AAAAAA TTTTTT Not I Sal I Digestão com NotI Sal I AAAAAA TTTTTT Not I 50

51 5. Ligação e Transformação Ligação no Plasmídio Plasmídio Sal I AAAAAA TTTTTT Not I Plasmídio E coli competente 51

52 6. Mini Prep 7. Seqüênciamento Plasmídio cdna 5 ACGTACGTACGTAC 3 TGCATGCATGCATG Primer 3 52

53 Qualidade das seqüências phred phrap consed 53

54 Bioinformática Phred/Phrap and Consed TATTATCGTATCCTGGTCATACCATTGA TCGTATCCTGGTCATACCATTGACTGGCTATAACTGCCTAGCT ATACCATTGACTGGCTATAACTGCCTAGCTCTTCGTAATCTAGTATTATATCG GACTGGCTATAACTGCCTAGCTCTTCGTAATCTAGTATTATATCGCATATCGTCGAT TGCCTAGCTCTTCGTAATCTAGTATTATATCGCATATCGTCGATGT TATTATCGTATCCTGGTCATACCATTGACTGGCTATAACTGCCTAGCTCTTCGTAATCTAGTATTATATCGCATATCGTCGATGT consenso Códon de iniciação ATG, TTG e GTG Stop Códon: TGA, TAG e TAA Porcentagem de GC do genoma ORFs Glimmer - RBSfinder 54

55 Obtenção da Seqüência de Nucleotídeos ATGGAAACTCGTTACTGGTACGCCTGCGGTACCGGTCCGGAATTCCCGG TCGACCCACGCGTCCGGCGAGTTCTTGGTTGACCTCTTCCTCTTCGACC ACCTCCCAGGCTCTTGGTGTAGCTTGCCACTCTCACCAATCAAGTTTTC ATCTCTCATCTCGACGTTCAGATCCCAACTGCCTTTCATCCCTTTGCTC ACCCCACTCGTGCCCACTCTGGTGCGGCAGCAGGATCAAAGGACTACGT Obtenção da Seqüência de Aminoácido Programas especiais que identificam seqüências de leitura aberta (ORF) - Glimmer RBSfinder atggaaactcgttactggtacgcctgcggtaccggtccggaattcccgggtcgacccacg M E T R Y W Y A C G T G P E F P G R P T cgtccggcgagttcttggttgacctcttcctcttcgaccacctcccaggctcttggtgta R P A S S W L T S S S S T T S Q A L G V gcttgccactctcaccaatcaagttttcatctctcatctcgacgttcagatcccaactgc A C H S H Q S S F H L S S R R S D P N C ctttcatccctttgctcaccccactcgtgcccactctggtgcggcagcaggatcaaagga L S S L C S P H S C P L W C G S R I K G ctacgt L R Comparação em bancos de dados disponíveis - BLAST Suposta Função da Proteína 55

56 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) conjunto de programas que buscam por similaridade entre seq no banco de dados. elaborados para explorar todas as seq possíveis no banco de dados (ptn ou DNA) probabilidades definidas para uma interpretação estatística da identidade (Altschul et al., 1990) 56

57 Impacto dos Projetos Genoma Treinamento de cientistas e estudantes em biologia molecular e genomica Avanços no conhecimento Aumento na qualidade científica Desenvolvimento de novas tecnologias Criação de novos negócios

58 A Era Pós-genômica Com o sequenciamento completo, precisa-se processar e relacionar os dados brutos e transformá-los em conhecimento Modelagem molecular: Computação gráfica Inteligência artificial Análise de Microarrays: Processamento de imagens Inteligência artificial Banco de dados

59 2002: Pat Brown DNA chips: microarrays 59

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