BIBLIOTECAS DE DNA E HIBRIDIZAÇÃO. FABIANA SEIXAS

Transcrição

1 BIBLIOTECAS DE DNA E HIBRIDIZAÇÃO FABIANA SEIXAS fabianak@ufpel.edu.br

2 ABORDAGENS... BIBLIOTECAS DE DNA -Bibliotecas de DNA Genômico -Bibliotecas de cdna TÉCNICAS DE HIBIDIZAÇÃO -Hibidização em Colônia -Southern blot

3 TIPOS DE VETORES

4 TIPOS DE VETORES Vetores Hospedeiros Utilização Plasmídeos Cosmídeos Bactérias / leveduras clonagem Bacteriófagos

5 VETORES PLASMIDIAIS Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossômico, que ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras puc18 pbr322 pup310 Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de até 9kb

6 Plasmídeo VETORES PLASMIDIAIS

7 BACTERIÓFAGO - Vírus que infectam bactérias; - DNA ou RNA; - Capsídeo - Biologia do fago - Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb

8 COSMÍDEOS -São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos; - Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35 kb;

9 BIBLIOTECAS DE DNA -Bibliotecas de DNA Genômico (fragmentos de DNA) - Bibliotecas de cdna (mrna)

10 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO É uma coleção de clones que representam a totalidade do genoma de um determinado organismo Consiste de todas as moléculas de DNA recombinantes que foram geradas pela ligação do DNA do organismo a um vetor (plasmideo, bacteriófago ou cosmídeo) Servem para isolar DNA específicos de um organismo

11 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO CARACTERÍSTICAS São usadas principalmente para procariotos Em eucariotos usa-se biblioteca genômica para estudo de regiões reguladoras Independe do típo de célula utilizada para a obtenção do DNA

12 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Representa todo o genoma de um organismo

13 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO

14 Bacteriófagos BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO

15 Cosmídios BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO

16 BIBLIOTECAS DE cdna EM EUCARIOTOS... Pequena porcentagem do genoma codifica mrna cdna

17 BIBLIOTECAS DE cdna É o conjunto de clones das seqüências codificadoras que estão sendo expressas pela célula naquele momento, obtido através da clonagem de moléculas cópias do mrna. É usada principalmente para células eucarióticas. Varia de acordo com o tecido utilizado.

18 BIBLIOTECAS DE cdna

19 BIBLIOTECAS DE cdna Síntese de cdna fita dupla

20 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO Clonagem de cdna em fago

21 Etapas na construção de uma Biblioteca genômica e de cdna BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO

22 SINTESE DE cdna Purificação do RNA Hibridização com poly(dt) Copia do DNA com RT Degradação do RNA Síntese de uma fita complementar

23 Biblioteca genômica: BIBLIOTECAS DE DNA - Representam uma amostra aleatória de todas as seqüências de DNA de um organismo Biblioteca de cdna - Contém moléculas que foram transcritas em mrna - Produção de grande quantidade de mrna por células especializadas - Varia de acordo com tipo e estado fisiológico da célula - mrna é processado DIFERENÇAS

24 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO Utilização de bibliotecas Screening Seqüenciamento de todos os insertos usando iniciadores do vetor Projetos genoma / transcriptoma

25 TIAGEM DE UMA BIBLIOTECA Detecção do produto do gene pela utilização de anticorpos Detecção do DNA através da técnica de hibridização

26 Triagem de uma biblioteca Sonda de DNA Conhecer parte da seqüência do gene Sequência completa do gene Utilizar sonda de oligonucleotídeos derivado de uma proteína Codon degenerado Conhecer cerca de 6aa contíguos Anticorpos

27 1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos

28 1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos

29 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS É a formação de molécula fita dupla, através do pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e outra de RNA complementares, mas de origens diferentes Hibridização Renaturação

30 SONDA de DNA - Seqüência de DNA Marcada Marcação da Sonda de DNA Radioativa: 32 P nick traslation Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalina

31 Marcação da Sonda de DNA Radioativa: 32 P nick traslation Cortar o DNA fita dupla Atividade Exonucleasica da DNA polimerase DNA fita simples Moléculas de DNA radioativas DNA polimerase preenche com nucleotídeos marcados Sondas

32 Marcação da Sonda de DNA Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalina Desnaturação DNA DNA fita simples Ligação Fraca + peroxidase complexada com polimero positivo (DNA+ Peroxidase) + glutaraldeído Sondas Covalentemente marcada com a enzima

33 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização 1 Placas com Colônias contendo os plasmídeos Lise das Bactérias Desnaturação do DNA Filme de Raio - X 5 4 Sonda

34 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização

35 Caracterização da seqüência encontrada Seqüenciamento de DNA PCR Expressão da sequência codificadora

36 Southern Blot - DNA Northern Blot - RNA Western Blot - Proteína

37 Southern Blot Sonda: seqüência de DNA marcada Transferência de DNA do gel para a membrana

38 NORTHERN BLOT 1. Extração do DNA 4. Geração de uma sonda marcada datp dttp dgtp dctp pgem-t 2. Eletroforese do RNA 5. Hibridização 6. Visualização 3. Transferencia para a menbrana

39 FIM???