Sessão 1: Os Princípios e as Técnicas da Biologia Molecular do Séc XXI

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1 Sessão 1: Os Princípios e as Técnicas da Biologia Molecular do Séc XXI

2 Menu do dia: -DNA RNA proteína - Sequenciação de genomas (Clonagem, electroforese em gel) - Transcritoma (Microarrays) - Organismos modelo - RNA interferência e mutagénese (RNAi, mutantes de Drosophila) - Immunostaining, live immaging e microscopia de fluorescência - Deteção de interactuantes de proteínas (complexos proteicos e complexos proteína-dna)

3 Célula Eucariótica

4 Célula Eucariótica

5 O núcleo e o conteúdo genético

6 Os genes ditam muitas das nossas caracteristicas...

7 Ciclo celular

8 Divisão celular

9 Divisão celular

10 Divisão celular

11 Replicação do DNA Polimerase de DNA Primase de DNA Polimerase de DNA Fragmento de Okasaki

12 DNA RNA Proteína DNA Membrana nuclear Transcrição de mrna RNA Polimerase mrna maduro - Splicing Amino ácidos Transporte para o citoplasma Tradução Cadeia de aminoácidos trna Anti-codão Codão mrna Ribossoma

13 Proteína só uma cadeia de aminoácidos? Amino ácidos Cadeia de aminoácidos trna Anti-codão Codão mrna Ribossoma

14 Cada proteína com a sua função...

15 Cada proteína com a sua função...

16 Cada proteína com a sua função...

17 Cada proteína com a sua função...

18 Cada proteína com a sua função...

19 Como saber a sequência de nucleótidos de uma proteína?

20 Como saber a sequência de nucleótidos de uma proteína?

21 Método de terminação de cadeia

22 Método de terminação de cadeia O DNA é desnaturado e amplificado em cadeias simples. O primer liga-se à cadeia template. dntps ddntps Os primer são desenhados para uma sequencia de DNA específica conhecida Podem ser combinados numa única reacção desde que estejam marcados com cores diferentes OU Separados em 4 reacções diferentes

23 Electroforese em gel Fonte de energia Poços para aplicar as amostras Tina Gel de agarose ou poliacrilamida Tampão Elétrodo

24 Sequenciação de fragmentos de DNA Os fragmentos de DNA ampliados são separados por electroforese, cada amostra numa posição diferente

25 Sequenciação de fragmentos de DNA Os fragmentos de DNA ampliados são separados por electroforese, cada amostra numa posição diferente Os fragmentos de DNA ampliados são separados por electroforese em capilar em simultâneo

26 Informação sobre todas as proteínas de um organismo Sequenciação de genomas! Isolamento do DNA Corte do DNA com enzimas expecificas ligação do DNA com enzimas expecificas Inserção dos vectores em bactérias Isolamento de DNA Colecção de DNA s de uma biblioteca genómica

27 Sequenciação shotgun

28 Next generation sequencing

29 Em que esta tecnologia pode ser útil?

30 Em que esta tecnologia pode ser útil?

31 Transcriptoma Chip de DNA Amostra controlo Amostra da experiência mrna Transcrição reversa cdna Scan com laser Hibridação com o DNA do chip Gene X

32 Vamos começar a estudar a função de uma proteína

33 Serão as descobertas feitas em mosca relevantes para os humanos?

34 Perda de função

35 Perda de função

36 Perda de função

37 Perda de função

38 Perda de função

39 Perda de função

40 Perda de função

41 Perda de função

42 Localização celular da proteína

43 Localização celular da proteína Amostra Fixação Anticorpo primário não marcado Anticorpo secundário (anti-imunoglobulina) fluorecsentement Permeabilização, as membranas celulares abrem poros para a entrada dos anticorpos

44 Localização celular da proteína Ocular Filtro Filtro Espelho Objectiva Lâmpada de fluorescência Especime Deteção do sinal com microscopia de fluorescência

45 As proteínas são dinâmicas

46 As proteínas são dinâmicas

47 Protein tagging para analisar a dinâmca das proteínas

48 Protein tagging para analisar a dinâmca das proteínas Ocular Filtro Filtro Espelho Objectiva Lâmpada de fluorescência Especime Deteção do sinal com microscopia de fluorescência

49 Immunostaining vs. Live immaging

50 As proteínas também têm amigos... Células contendo as proteínas de interesse Lisado celular Adicionr anticorpo contra uma das proteínas Adicionr beads que se ligam ao anticorpo Imunoprecipitação das proteínas de interesse Lavar e recolher as proteínas que foram imunoprecipitadas

51 As proteínas também têm amigos...

52 As proteínas também têm amigos... Separar as proteínas por electroforese num gel de poliacrilamida Gel As proteínas são transferidas do gel para a membrana Gel Electrodo e tampão Membrana Deteçaõ por luminescência. Mostra apenas as bandas (proteínas) que foram reconhecidas pelo anticorpo Adicionar anticorpo primário seguido de anticorpo secundário

53 As proteínas também têm amigos... Hemolinfa de Drosophila Comida normal Restrição alimentar Anticorpo para Insulina Anticorpo para uma proteína não relacionada com a experência Deteçaõ por luminescência. Mostra apenas as bandas (proteínas) que foram reconhecidas pelo anticorpo

54 As proteínas também têm amigos...

55 Os amiguinhos das proteínas Células contendo as proteínas de interesse crosslinking com DNA Lisado celular e quebra do DNA Adicionr anticorpo contra a proteína de interesse Adicionr esferas magnéticas que se ligam ao anticorpo Degradar as proteínas ligadas ao DNA

56 Os amiguinhos das proteínas DNA pronto para a análise ChIP-chip Hibrididar com microarray ChIP-seq Sequenciar e mapear em genoma de referência

57 Em conclusão

58 Obrigada