Bases e aplicações. da tecnologia do DNA recombinante

Transcrição

1 Bases e aplicações da tecnologia do DNA recombinante

2 Por quê entender a Tecnologia do DNA recombinante? y y Doenças: diagnóstico, prognóstico e tratamento Compreensão dos mecanismos biológicos y y y organismos sadios desenvolvimento doenças O que é a tecnologia do DNA recombinante? y y imitação da vida compreensão da organização e dos mecanismos naturais

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5 Microarray AND human disease

6 Application of microarray technology in pulmonary diseases Argyris Tzouvelekis, George Patlakas and Demosthenes Bouros Department of Pneumonology, Medical School, Democritus University of Thrace, Greece Respiratory Research 2004, 5:26 doi: /

7 Análise comparativa da expressão gênica em larga escala Identificação de genes associados com causa ou predisposição a doenças

8 Hibridização de ácidos nucléicos

9 A estrutura do DNA segundo Watson e Crick

10 A estrutura do DNA e a replicação semiconservativa

11 Replicação do DNA e sua maquinaria enzimática

12 Transcrição e sua maquinaria enzimática

13 Transcriptase Reversa: DNA polimerase dependente de RNA conversão do mrna em cdna AAAAA RT TTTTT Iniciador Oligo dt RT AAAAA TTTTT pol AAAAA TTTTT Transcriptase Reversa (RT) sintetiza a primeira fita do cdna cdna dupla fita

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16 1. Bactérias podem sentir o ambiente, distinguir entre tipos celulares e entregar proteínas a células eucarióticas. 2. Invasinas de uma bactéria patogênica transferidas para Escherichia coli para invadir células tumorais

17 As bases da tecnologia do DNA recombinante

18 Descoberta do sistema restrição-modificação Luria e Human, 1952, Arber e Dussoix, 1962 (restrição) Endonucleases sítio específicas (1970/71, Smith e Nathans)

19 Genética de bactérias fagos e plasmídeos DNA da E. coli Transformação de E. coli Plasmídeos Seleção de células transformadas

20 Dupla fita de DNA + Maquinaria de replicação Separação das fitas - Helicases Ajuste topológico - Topoisomerases Estabilização da bolha - SSBs Adição de iniciadores - Primase Polimerização - DNA Pol III Retirada dos iniciadores (oligo-rna) - DNA Pol I Correção das quebras na cadeia - DNA ligase

21 Clonagem Isolamento e propagação de moléculas idênticas E mais... A expressão de proteínas heterólogas

22 Seqüenciamento enciamento do DNA 5 -CCTCTGAATGTCCTTTCTCTAAGTCCTAAGTCCTCCGGATGGTACTTCTAGTTC-3 Iniciadores sintéticos 5 -CCTCTGAATGTCCTTTCTCTAAGTCCTAAGTCCTCCGGATGGTACTTCTAGTTC-3 5 -CCTCTGAATGTCCTTTCTCTAAG-3 POLIMERASE + G C G T T G A T T A C G T G T A A T A A C C G A T G C G T A C G G 5 -CCTCTGAATGTCCTTTCTCTAAGTCCTAAGTCCTCCGGATG

23 Seqüenciamento enciamento do DNA

24 Diagnóstico Molecular

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26 As bibliotecas genômicas e os projetos genoma

27 Projetos Genoma: The end of the beginning Genética Clássica Watson e Crick Maxam & Gilbert +Sanger & Coulson Biologia Molecular + Genética Reversa Abordagem gene a gene Biologia Molecular em Escala Genômica (90s )

28 Projeto Genoma Humano

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30 Projetos Genoma de procariotos Procariotos: genoma circular alta densidade gênica colinearidade ~1 gene/1000 pares de bases

31 Projetos genoma: uma nova visão Treponema: 1,138kb 1041 genes (1 gene/1kb) virulência diferenças metabólicas alvos de drogas

32 Buscando genes ou identificando diferenças: amplificação por PCR

33 PCR - Reação em cadeia da polimerase

34 Maquinaria da Replicação Separação das fitas - Helicases Ajuste topológico - Topoisomerases Estabilização da bolha - SSBs Adição de inicadores - Primase Polimerização - DNA Pol III Retirada dos iniciadores (oligo-rna) - DNA Pol I Correção das quebras na cadeia - DNA ligase

35 PCR Separação das fitas - CALOR Ajuste topológico - Topoisomerases Estabilização da bolha - SSBs Adição de iniciadores - Oligonucleotídeos sintéticos Polimerização - Taq DNA Polimerase Retirada dos iniciadores (oligo-rna) - DNA Pol I Correção das quebras na cadeia - DNA ligase

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