introdução ao curso

Transcrição

1 introdução ao curso

2 Cronograma aulas teóricas Aulas teóricas (Segundas-feiras - Sala 146) 30/07-introdução ao curso. 06/08-Busca em bancos de dados 13/08- Alinhamento local 20/08- Alinhamento local 27/08-Domínios proteicos 03/09- -Semana da pátria 10/09- Alinhamento global 17/09- Analise filogenética baseada em alinhamento de domínios 24/09-Predição de estrutura proteica/modificações em proteínas 01/10- Seqüenciamento de genomas/transcriptomas 08/10- Anotação de genomas 15/10 Semana da graduação 22/10- Previsão de vias metabólicas a partir do genoma (entrega das questões do trabalho aos alunos) 29/10- Uso de microarrays para a medida de níveis relativos de transcrição 05/11- RNAseq (entrega do trabalho ao professor) 12/11-identificação de proteínas através de espectrometria de massa 19/11- Prova 2 26/11-Prova substitutiva

3 Cronograma aulas praticas Aulas praticas (quartas-feiras Sala 206) 01/08-processamento de cromatogramas- montagem de sequências 08/08-busca em bancos de dados 15/08-Feriado municipal 22/08- Uso de BLAST como ferramenta de alinhamento local 29/08- Busca no PFAM, CDD,SMART,Intrepro e COG 05/09- Semana da pátria 12/09-uso do CLUSTAL como ferramenta de alinhamento global 19/09- Analise filogenética baseada em alinhamento de domínios 26/09- Predição de estrutura proteica/modificações em proteínas 03/10- Prova 1. 10/10- Analise de ESTs e mapeamento de ESTs no genoma 17/10- Semana da graduação 24/10- Anotação de genomas 31/10- Período para realização do trabalho. 07/11- Analise de dados de expressão 14/11-Identificação de proteínas através da analise de espectros de massa

4 Avaliação Avaliação:- A nota final será calculada seguindo a seguinte formula: (NP1+NP2+NT)/3)*0.9+R*0.1 Onde: NP- notas das provas NT- nota dos trabalho R: relatórios da aula pratica É exigida presença em 70% das aulas.

5 Objetivos do curso Preparar o aluno para realizar analises de informações provenientes de moléculas de RNA, DNA e proteínas Ênfase no uso de ferramentas disponíveis para correlacionar esta informação com funções biológicas destas moléculas

6 Objetivos do curso Qual a importância de processar e interpretar informações contidas em biomoléculas? Como realizar comparações entre biomoléculas provenientes de diferentes organismos? Como estas informações se correlacionam com as características de um organismo?

7 Crescimento dos bancos de dados de moléculas biológicas Qual a importância desta informação para justificar os bilhões de dólares investidos na produção desta informação? O que ocorreu a partir de meados da década de 90 para justificar este aumento no numero de seqüência depositadas?

8 Avanços na clonagem e seqüenciamento de DNA Avery fornece evidencia que o DNA carrega a informação genética Watson e Crick propõem o modelo de dupla hélice para o DNA Kornberg descobre a DNA polimerase Arber fornece evidencia da existência de enzimas nucleases de restrição Gellert descobre a DNA ligase técnicas de clonagem de DNA são desenvolvidas por Boyer, Cohen, Berg e colegas Sanger e Barrell e Maxam e Gilbert desenvolvem métodos rápidos de seqüenciamento de DNA 1985-Mullis e colegas inventam a reação em cadeia da polimerase (PCR) Simon e colegas estudam como utilizar cromossomos artificiais de bacterias (BACs) para clonagem de moleculas grandes de DNA de humano Hood and Hunkapillar introduzem uma nova tecnologia de seqüenciamento de DNA automatizado.

9 Avanços no seqüenciamento de genomas Venter e colegas seqüenciam o primeiro genoma completo, o da bactéria Haemophilus influenzae Goffeau e um consorcio internacional anunciam a finalização da primeira seqüência genômica de um eucarioto, a levedura Saccharomyces cerevisiae Sulston,Waterston e colegas produzem o primeiro genoma completo de um organismo multicelular, o verme nematodo Caenorhabditis elegans Venter e colegas produzem o primeiro genoma de um organismo multicelular utilizando a metodologia de Whole Genome Shotgun 2001 Dois consórcios independentes anunciam a finalização de um esboço do genoma humano Primeiro genoma diploide de um individuo (Venter) foi sequenciado

10 Seqüenciamento manual de DNA utilizando a técnica de Sanger Seqüenciamento pelo método de Sanger permite obter informações de algumas centenas de pares de bases a partir do inicio do seqüenciamento

11 Seqüenciamento manual de DNA utilizando a técnica de Sanger Utilização de autoradiografia para obtenção de resultados Necessidade de utilizar nucleotídeos radioativos e esperar pela sensibilização do filme fotográfico Leitura de bases realizada manualmente Dificuldade em implementar procedimentos em larga escala com este tipo de abordagem

12 Seqüenciamento automático de DNA utilizando a técnica de Sanger Utilização de dideoxi-nucleotideos ligados a diferentes moléculas fluorescentes

13 Seqüenciamento automático de DNA utilizando a técnica de Sanger Cada faixa colorida representa uma seqüência que é automaticamente convertida em um cromatograma, que por sua vez é interpretado para a obtenção da seqüência de DNA 96 seqüência com algumas centenas de bases podem ser produzidas em algumas horas Imagem virtual de um gel de seqüenciamento de DNA Cromatograma com interpretação de seqüência

14 Limitações da técnica de Sanger Utilizando a técnica de Sanger só é possível seqüenciar algumas centenas de bases por cada reação O seqüenciamento sempre se inicia de um ponto arbitrário que tem que ter a seqüência conhecida para o desenho do primer Cada reação de seqüenciamento só pode conter moléculas com seqüência idênticas ou há um embaralhamento de seqüências A solução encontrada para seqüenciamento de moléculas desconhecidas é clonar o DNA em um vetor e iniciar o seqüenciamento a partir da porção do vetor adjacente ao DNA desconhecido

15 Novas tecnologias de seqüenciamento PCR em emulsão acoplado com pirosequenciamento Geram-se seqüências entre 200 a 300 bases em uma corrida de algumas horas

16 Novas tecnologias de seqüenciamento

17 Informação em moléculas biológicas TTGTTTGTTTGTTGTGTTTTCCCTGGCAAACAGCTGGAGAAAGAGCAGCTCATGGAGAGGCTGAGAGAAG CGGTTTTCGCGTCCTACCCAAACTGGGAGAGTAACCTTCAGCAGCTGGACTCACCGATTGGTTTTCCTTC ATTTTCAGTGAAATCCCATTCTCTGGCTGGAGACACAGATGGCCTCAAATGAGAGAGATGCTATATCGTG GTACCAAAAGAAGATTGGAGCCTACGATCAGCAGATATGGGAAAAGTCAATCGAACAGACTCAGATTAAG GGTTTGAAAAACAAACCGAAAAAGATGGGCCACATAAAGCCAGACTTGATTGACGTTGACTTAATCAGAG GGTCAACATTTGCCAAAGCAAAACCTGAAATTCCATGGACATCTCTGACTCGGAAGGGGCTTGTTCGAGT TGTATTTTTTCCATTGTTCAGCAATTGGTGGATTCAGGTTACCTCTTTAAGAATCTTTGTTTGGCTGTTA CTACTTTATTTCATGCAAGTTATAGCAATTGTCTTATATTTGATGATGCCTATTGTGAACATAAGTGAAG TACTTGGACCCTTGTGCCTTATGCTACTCATGGGAACTGTCCACTGTCAAATTGTGTCTACTCAGATAAC AAGACCATCAGGAAACAATGGAAATCGAAGAAGAAGAAAATTACGAAAAACTGTAAATGGTGATGGGAGC CGAGAAAATGGAAATAACTCCTCTGATAAAGTCAGAGGAATAGAAACTTTGGAATCTGTACCCATTATTG GTGGTTTTTGGGAGACTATCTTTGGCAACAGGAGGCTTTTAGGCGTTTGGGTAATGGGGTGTCTGATGAC CTGTCAAGTGAAGAAGATGGTGAAGCACGGACACAGATGATATTATTGCGTAGGAGTGTGGAAGGGGCCT CAAGTGACAATGGTTGTGAAGTTAAGAATAGAAAATCAATACTTTCAAGGCACCTAAACTCTCAGGTAAA GAAAACCACTACAAGGTGGTGTCATATTGTGCGGGATTCAGATAGTCTGGCTGAATCAGAATTTGAATCA GCAGCCTTCAGCCAGGGCTCTAGATCGGGTGTGAGTGGTGGCTCTCGAAGCCTCAACATGTCAAGAAGAG ACTCAGAAAGCACCCGCCATGACTCGGAGACTGAGGACATGTTATGGGACGACCTGCTACATGGCCCAGA GTGCCGGTCATCTGTCACCAGTGACAGTGAGGGGGCCCATGTGAATACCCTTCACTCAGGGACCAAACGT GACCCCAAAGAGGATGTTTTTCAGCAGAATCATTTATTCTGGCTTCAGAATTCAAGTCCTTCCTCTGATC GAGTTAGTGCAATAATCTGGGAGGGGAATGAGTGCAAAAAGATGGATATGTCTGTGTTGGAAATAAGTGG CATCATCATGAGCAGGGTCAATGCCTATCAGCAAGGAGTAGGTTATCAGATGCTGGGAAATGTTGTCACT ATTGGATTAGCATTTTTTCCATTCTTACATCGACT Seqüência DNA 1 TGGGAATAGTCCTGACAACCCCTATTGCGATCAGCTCTTTTGCTTCTACCGAGACTTTATCGTTTACTCC TGACAACATAAATGCGGACATTAGTCTTGGAACTCTGAGCGGAAAAACAAAAGAGCGTGTTTATCTAGCC GAAGAAGGAGGCCGAAAGGTCAGTCAACTTGACTGGAAATTCAATAACGCTGCAATTATTAAAGGTGCAA TTAATTGGGATTTGATGCCCCAGATATCTATCGGGGCTGCTGGCTGGACAACTCTCGGTAGCCGAGGTGG CAATATGGTCGATCGGGACTGGATGGATTCCAGTAACCCCGGAACCTGGACGGATGAAAGTAGACACCCT GATACACAACTCAATTATGCCAACGAATTTGATCTGAATATCAGAGGCTGGCTCCCCAACGAACCCAATT ACCGCCTGGGACTCATGGCCGGATATCAGGAAAGCCGTTATAGCTTTACAGCCAGAGGGGGTTCCTATAT CTACAGTTCTGAGGAGGGATTCAGAGATGATATCGGCTCCTTCCCGAATGGAGAAAGAGCAATCGGCTAC AAACAACGTTTTAAAATGCCCTACATTGGCTTGACTGGAAGTTATCGTTATGAAGATTTTGAGCTAGGTG GTACATTTAAATACAGCGGCTGGGTGGAAGCATTTGATAACGATGAACACTATGACCCAGGAAAAAGAAT CACTTATCGCAGTAAAGTCAAAGACCAAAATTACTATTCTGTTGCAGTCAATGCAGGTTATTACGTAACG CCTAATGCAAAAGTTTATATTGAAGGCGCATGGAATCGGGTTACGAATAAAAAAGGTGATACTTCACTTT ATGATCACAATGATAACACTTCTGACTACAGCAAAAATGGTGCAGGCATAGAAAACTATAACTTCATCAC TACTGCTGGTC Seqüência DNA 2 Qual a diferença entre estas duas moléculas?

18 Informação em moléculas biológicas TTGTTTGTTTGTTGTGTTTTCCCTGGCAAACAGCTGGAGAAAGAGCAGCTCATGGAGAGGCTGAGAGAAG CGGTTTTCGCGTCCTACCCAAACTGGGAGAGTAACCTTCAGCAGCTGGACTCACCGATTGGTTTTCCTTC ATTTTCAGTGAAATCCCATTCTCTGGCTGGAGACACAGATGGCCTCAAATGAGAGAGATGCTATATCGTG GTACCAAAAGAAGATTGGAGCCTACGATCAGCAGATATGGGAAAAGTCAATCGAACAGACTCAGATTAAG GGTTTGAAAAACAAACCGAAAAAGATGGGCCACATAAAGCCAGACTTGATTGACGTTGACTTAATCAGAG GGTCAACATTTGCCAAAGCAAAACCTGAAATTCCATGGACATCTCTGACTCGGAAGGGGCTTGTTCGAGT TGTATTTTTTCCATTGTTCAGCAATTGGTGGATTCAGGTTACCTCTTTAAGAATCTTTGTTTGGCTGTTA CTACTTTATTTCATGCAAGTTATAGCAATTGTCTTATATTTGATGATGCCTATTGTGAACATAAGTGAAG TACTTGGACCCTTGTGCCTTATGCTACTCATGGGAACTGTCCACTGTCAAATTGTGTCTACTCAGATAAC AAGACCATCAGGAAACAATGGAAATCGAAGAAGAAGAAAATTACGAAAAACTGTAAATGGTGATGGGAGC CGAGAAAATGGAAATAACTCCTCTGATAAAGTCAGAGGAATAGAAACTTTGGAATCTGTACCCATTATTG GTGGTTTTTGGGAGACTATCTTTGGCAACAGGAGGCTTTTAGGCGTTTGGGTAATGGGGTGTCTGATGAC CTGTCAAGTGAAGAAGATGGTGAAGCACGGACACAGATGATATTATTGCGTAGGAGTGTGGAAGGGGCCT CAAGTGACAATGGTTGTGAAGTTAAGAATAGAAAATCAATACTTTCAAGGCACCTAAACTCTCAGGTAAA GAAAACCACTACAAGGTGGTGTCATATTGTGCGGGATTCAGATAGTCTGGCTGAATCAGAATTTGAATCA GCAGCCTTCAGCCAGGGCTCTAGATCGGGTGTGAGTGGTGGCTCTCGAAGCCTCAACATGTCAAGAAGAG ACTCAGAAAGCACCCGCCATGACTCGGAGACTGAGGACATGTTATGGGACGACCTGCTACATGGCCCAGA GTGCCGGTCATCTGTCACCAGTGACAGTGAGGGGGCCCATGTGAATACCCTTCACTCAGGGACCAAACGT GACCCCAAAGAGGATGTTTTTCAGCAGAATCATTTATTCTGGCTTCAGAATTCAAGTCCTTCCTCTGATC GAGTTAGTGCAATAATCTGGGAGGGGAATGAGTGCAAAAAGATGGATATGTCTGTGTTGGAAATAAGTGG CATCATCATGAGCAGGGTCAATGCCTATCAGCAAGGAGTAGGTTATCAGATGCTGGGAAATGTTGTCACT ATTGGATTAGCATTTTTTCCATTCTTACATCGACT Seqüência DNA Homo Sapiens transcription factor TGGGAATAGTCCTGACAACCCCTATTGCGATCAGCTCTTTTGCTTCTACCGAGACTTTATCGTTTACTCC TGACAACATAAATGCGGACATTAGTCTTGGAACTCTGAGCGGAAAAACAAAAGAGCGTGTTTATCTAGCC GAAGAAGGAGGCCGAAAGGTCAGTCAACTTGACTGGAAATTCAATAACGCTGCAATTATTAAAGGTGCAA TTAATTGGGATTTGATGCCCCAGATATCTATCGGGGCTGCTGGCTGGACAACTCTCGGTAGCCGAGGTGG CAATATGGTCGATCGGGACTGGATGGATTCCAGTAACCCCGGAACCTGGACGGATGAAAGTAGACACCCT GATACACAACTCAATTATGCCAACGAATTTGATCTGAATATCAGAGGCTGGCTCCCCAACGAACCCAATT ACCGCCTGGGACTCATGGCCGGATATCAGGAAAGCCGTTATAGCTTTACAGCCAGAGGGGGTTCCTATAT CTACAGTTCTGAGGAGGGATTCAGAGATGATATCGGCTCCTTCCCGAATGGAGAAAGAGCAATCGGCTAC AAACAACGTTTTAAAATGCCCTACATTGGCTTGACTGGAAGTTATCGTTATGAAGATTTTGAGCTAGGTG GTACATTTAAATACAGCGGCTGGGTGGAAGCATTTGATAACGATGAACACTATGACCCAGGAAAAAGAAT CACTTATCGCAGTAAAGTCAAAGACCAAAATTACTATTCTGTTGCAGTCAATGCAGGTTATTACGTAACG CCTAATGCAAAAGTTTATATTGAAGGCGCATGGAATCGGGTTACGAATAAAAAAGGTGATACTTCACTTT ATGATCACAATGATAACACTTCTGACTACAGCAAAAATGGTGCAGGCATAGAAAACTATAACTTCATCAC TACTGCTGGTC Seqüência DNA Escherichia coli protease T

19 Informação em moléculas biológicas -mrna e proteínas são polímeros biológicos que contem informações complexas e cada organismo possui milhares de moléculas diferentes para cada um deste tipos de moléculas. DNA normalmente possui poucas moléculas diferentes mas estas são muito longas. -A interpretação das informações contidas nestas moléculas biológicas não é trivial -No caso de moléculas como RNA e proteínas existe uma variação do seu nível relativo de produção das diversas moléculas dependente do tipo de tecido, estagio de desenvolvimento, estímulos externos, etc.. Portanto a própria medida da abundancia destas moléculas representa uma importante informação

20 Informação em moléculas biológicas Genoma Transcriptoma Proteoma Genoma e transcriptoma- informação pode ser obtida através de técnicas de seqüenciamento Proteôma- Seqüenciamento de proteínas é muito ineficiente. Técnicas atuais permitem a dedução de pequenos fragmentos

21 Informação em moléculas biológicas Maioria das informações obtidas é para as moléculas de DNA e RNA. As proteínas são as moléculas efetoras da maioria de processos celulares e portanto são as moléculas de maior interesse para entendimento de processos biológicos Devemos nos lembrar que a molécula de mrna contém a informação para a produção de uma proteína e é possível interpretá-la com o conhecimento do código genético A partir de uma seqüência de proteína não é possível, a principio, deduzir sua função Entretanto é possível prever que a proteína de interesse tenha função semelhante àquela de uma proteína de função conhecida que tenha seqüência similar

22 Operações básicas no processamento de seqüências biologicas -Tradução RNA para proteína -Complemento-reverso de fitas de DNA -Calculo peso molecular-pi de uma proteína

23 Predição de seqüência de proteínas a partir do cdna

24 Predição de seqüência de proteínas a partir do cdna

25 Predição de seqüência de proteínas a partir do cdna