Introdução às Tecnologias de Sequeciamento: Sanger e Nova Geração (NGS)
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- Maria do Pilar Nunes
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1 Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Campus de Jaboticabal Introdução às Tecnologias de Sequeciamento: Sanger e Nova Geração (NGS) Dr. Camila Cesário Fernandes LMSeq Laboratório Multiusuário de Sequenciamento Agosto 2018
2 Definir a sequência de nucleotídeos...
3 Watson e Crick Modelos dupla hélice do DNA Maxam e Gilbert Método de clivagem química
4 Sequenciamento Primeiras Metodologias: Protocolo Plus-Minus Protocolo de Clivagem Química
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7 ION Torrent Illumina Pirosequenciador 454 Sanger - capilar Pacific Biosciencies Nanopore
8 Sequenciamento Metodologias de 1ª Geração: Sanger
9 Clonagem de um fragmento de DNA alvo em Escherichia coli
10 DNA FRAGMENTO ALVO PCR
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14 ABI 3130 ABI 3130 xl ABI 3500 ABI 3730 xl
15 O método Sanger permite o sequenciamento de 500 a 800, até 1000 pb, dependendo do equipamento e do material que está sendo sequenciado. Margem de erro da Taq DNA polimerase é de 1% até os primeiros 350 nucleotídeos sequenciados e de 17% acima dos 500 nucleotídeos sequenciados (Koop et al., 1993, Biotechniques); Taq DNA polimerase High Fidelity menor erro; Método laborioso e demorado; Método de clonagem requer grande quantidade de DNA genômico e nem sempre o fragmento esperado é clonado.
16 Sequeciamento Metodologias de 2ª Geração: Redução nos custos e aumento do número de reads
17 Primeiro sequenciador NGS
18 O método de clonagem foi substituído pela ligação de adaptadores às extremidades do fragmento de DNA que permite a amplificação de genomas complexos com a utilização de primers comuns BIBLIOTECAS DE FRAGMENTOS
19 Emulsion PCR tecnologia empregada para o 454 (Roche), Ion Torrent (ThermoFisher Scientific) Após a ligação dos adaptadores, cada molécula de DNA (fita simples) é capturada, sob condições ideais, por uma bead (esfera) A reação consiste na mistura de uma emulsão de óleo utilizada para capturar os complexos DNA-esferas em simples gotículas aquosas
20 Após a amplificação e o enriquecimento das esferas (PCR em emulsão), as mesmas, aos milhões, podem ser depositadas em pocinhos individuais em placas PicoTiter
21 SEQUENCIAMENTO POR SÍNTESE
22 Química: pirosequenciamento Bibliotecas fragmentos e mate-pair Comprimento médio de leitura: 330 bases Tempo de corrida em dias: 0,35 para 0,45 Gb ( pb) Vantagens: leituras longas possibilita o mapeamento de regiões repetitivas do DNA, curto tempo de corrida Desvantagens: alto custo de reagentes; alta taxa de erros de inserção Aplicações: sequenciamento de novo, captura de exons em média escala, 16S em metagenômica Descontinuado
23 MiSeq - Flowcell
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26 Amplicação fase-sólida (Bridge amplification): primers forward e reverse de alta densidade são covalentemente aderidos à uma lâmina de vidro. Essa amplificação pode produzir de milhões de clusters separados espacialmente, deixando uma extremidade livre para que o primer universal possa ser hibridizado a fim de se iniciar o sequenciamento
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29 Química: terminador reversível Biblioteca: fragmentos e mate-pair Comprimento médio de leitura: bases Tempo de corrida em dias: depende da biblioteca e do equipamento Adaptadores: P5 e P7 Vantagens: atualmente é uma das plataformas mais utilizadas Desvantagens: erros de substituição Aplicação: sequenciamento de novo, exoma, target resequencing, possibilita a descoberta de genes em metagenômica, expressão gênica (RNA-Seq).
30 ION S5
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32 SEQUENCIAMENTO POR SÍNTESE
33 Química: semicondutor Biblioteca: fragmentos (single-read) e mate-pair (paired-end) PGM fragmentos (single-read) - PROTON Comprimento médio de leitura: bases, sendo gerados de 3Mb a 2Gb - PGM 200 bases, sendo gerados até 20Gb PROTON Tempo de corrida: 3-8 horas Adaptadores: A e P1 Vantagens: alta acurácia, baixo custo, rapidez Desvantagens: erros de inserção e deleção Aplicação: pequenos genomas, target resequencing, diversidade metagenômica (16S rrna) PGM sequenciamento de novo, exoma, target resequencing, possibilita descoberta de genes em metagenômica - PROTON
34 Sequeciamento Metodologias de 3ª Geração: Metodologias sem necessidade de amplificação
35 Sequenciamento de leituras longas
36 PacBio sequenciamento de fragmentos longos
37 Metzker, 2010, Nature
38 Para ajudar a entender como o PacBio funciona
39 Química: real-time Biblioteca de fragmentos, molécula única Comprimento médio de leitura: de 10 a 20Kb Vantagens: possui o maior potencial de leitura acima de 1kb Desvantagens: possui as maiores taxas de erro (15%) se comparada com as outras tecnologias de sequenciadores de nova geração Aplicação: sequenciamento completo de genomas, complementa os esforços de re-sequenciamento na descoberta de grandes variações estruturais e haplótipos.
40 Sequenciamento de leituras longas
41 Sequenciamento Nanopore
42 SEQUENCIAMENTO DE LEITURAS LONGAS SINTÉTICAS 10X Genomics
43 SEQUENCIAMENTO DE LEITURAS LONGAS SINTÉTICAS Illumina
44 Obrigado! Contato: Tel: (16) ramal: 8095
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