Marcadores Moleculares

Transcrição

1 Marcadores Moleculares

2 Marcadores Genéticos Características polimórficas: marcadores de variabilidade genética entre indivíduos, populações, espécies e taxons superiores. Marcadores moleculares: características moleculares polimórficas.

3 Marcadores Moleculares Proteínas/Enzimas. Genes. Segmentos de DNA não codificadores.

4 Marcadores Moleculares

5 Tipos de marcadores Técnicas não baseadas em PCR: Alozimas; RFLP; Minissatélites.

6 Alozimas Variantes alélicas de enzimas codificadas por genes estruturais. Aplicações: genética de populações e estudos de padrão de herança. Vantagens: baixo custo e baixa demanda técnica, alta reprodutibilidade, alelos codominantes. Desvantagens: baixa abundância, baixo nível de polimorfismo e co-migração de não homólogos.

7 Silene latifolia ssp. alba

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11 G6PD cromossomo X

12 BChE

13 RFLP Restriction fragment Length Polymorphism Polimorfismo de tamanho dos fragmentos de restrição. Aplicações: análise sistemática; mapeamento de genes; genética de populações. Vantagens: abundância genômica; alelos codominantes e alta reprodutibilidade. Desvantagens: alta demanda técnica e de trabalho, grande quantidade de DNA de alto peso molecular.

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15 Minissatélites (VNTR/LTR) Hibridização Southern blot: sondas multilocus. Aplicações: DNA fingerprinting (genética forense) Vantagens: alto nível de polimorfismo e alta reprodutibilidade Desvantagens: altos custos e demanda técnica; sem especificidade de locus ou de alelos. Sondas locus específicas: clonagem molecular de fragmentos de restrição.

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17 Técnicas baseadas em PCR: RAPD; SCAR; SSCP; PCR-RFLP; Microssatélites; Sequenciamento de DNA.

18 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) PCR com primers curtos (10 pb) de sequência randômica. Um primer forward e reverse amplifica fragmentos em 1 10 sítios genômicos simultaneamente. Fragmentos entre 0,5 5 kb: presença e ausência de bandas Aplicações: mapeamento de genes; identificação genética de indivíduos e de linhagens e de espécies próximas. Vantagens: alta abundânica genômica; alto nível de polimorfismo; pequena quantidade de DNA; disponibilidade de primers randômicos. Desvantagens: baixa reprodutibilidade; locus inespecífico e alelos dominantes.

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20 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) Amplificação com primers específicos (15-30 pb) a partir das sequências de nucleotídeos de fragmentos de RAPD clonados. Polimorfismos de tamanho são detectados por eletroforese. Aplicações: mapeamento de genes e melhoramento genético Vantagens: rápido e fácil; alta reprodutibilidade; alelos codominantes e pequena quantidade de DNA. Desvantagens: ensaio de RAPD prévio e sequência conhecida para desenhar primers específicos.

21 SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) Fragmentos de DNA ( pb) amplificados por PCR primers (20-25 pb). DNA é desnaturado antes da eletroforese (calor, NaOH e formamida) e o gel não é desnaturante. Aplicações: detecção de mutação em regiões de sequência conhecida (principalmente genes) e estudos de associação. Vantagens: alelos codominantes e pequena quantidade de DNA. Desvantagens: sequência conhecida; controle das condições de eletroforese; uso de controles e fragmentos pequenos.

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23 Exemplo PCR-SSCP

24 PCR -RFLP (Restriction fragments length polymorphism) Fragmentos de DNA amplificados por PCR (300 a 1800 pb) primers específicos (20-25 pb). Digestão dos fragmentos amplificados com enzimas de restrição:polimorfismos de tamanho variação na ocorrência de sítios de restrição. Aplicações: mapeamento de genes; estudos de associação. Vantagens: alelos codominantes; pequena quantidade de DNA e alta reprodutibilidade. Desvantagens: sequência conhecida para desenho de primers específicos, baixa abundância genômica.

25 Criando um sítio de restrição ALA Sequência normal...5'..gaa GCA GAA TGG...GCA GG...3' Iniciador (3') GT CGT ACC...CGT CC Produto da PCR 5'..GAA GCA GCA TGG...3' Fnu4HI ou BsoFI 85 pb ' 21 pb

26 Gel de agarose, mostrando os 3 genótipos

27 DNA Repetitivo Moderadamente repetitivo: 30% Altamente repetitivo: 10% Repetições em tandem Satélite Minissatélite Microssatélite Repetições dispersas

28 DNA Repetitivo em tandem Satélite (bloco total: 100 Kb até 1Mb) Tipo 1 unidade de repetição: 28-48pb: heterocromatina centromérica. Tipo 2 e 3-5pb: em todos cromossomos Tipo alfa 171pb: heterocromatina centromérica Tipo beta 68pb: heterocromatina centromérica dos cromos. 1, 9, 13, 14, 15, 21, 22 e Y

29 DNA Repetitivo em tandem Minissatélite (bloco: 0,1 até 20 Kb) Família telomérica tamanho da unidade de 6 pb: todos os telômeros Família hipervariável 9 a 24 pb: todos os cromossomos, em geral na proximidade dos telômeros Microssatélite (bloco: menor que 150 pb) Tamanho da repetição 1 a 4 pb: todos os cromossomos

30 Microssatélites (STR) Aplicações: genética de populações, mapeamento de genes, genética forense. Vantagens: alta abundânica genômica, alto nível de polimorfismo, pequena quantidade de DNA, alta reprodutibilidade, alelos codominantes, locus específicos. Desvantagens: alelos nulos mutações no sítio de anelamento dos primers, erros de amplificação.

31 Alelo 1 15 repetições CA Alelo 2 17 repetições CA Alelo 3 18 repetições CA

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34 Sequenciamento Método de Sanger NGS

35 Diferentes características e aplicações Abundância genômica. Nível de polimorfismo. Especificidade de locus. Codominância dos alelos. Reprodutibilidade. Quantidade de DNA. Custos. Acessibilidade técnica.

36 Aplicações

37 Busca por genes candidatos Região do DNA associada a uma característica de interesse (estudos de associação). Mapas físicos de cromossomos e de genomas: marcadores moleculares. Estudos de ligação entre alelo do marcador molecular e característica de interesse. Sequenciamento da região do marcador molecular e busca por genes candidatos.

38 Genética forense. Ferramentas de manejo: genética da conservação. Auxiliares na análise sistemática: diferenças e semelhanças evolutivas entre os táxons.

39 QTLs (Locos de Características Quantitativas) Complexidade da Arquitetura Genômica: nº de Locos; suas interações e seus efeitos fenotípicos. Tamanho da amostra, densidade de marcadores, distribuição de marcadores, número de características quantitativas consideradas.

40 Projeto 1000 genomas

41 Projeto 1000 genomas O Projeto 1000 Genomas funcionou entre 2008 e 2015, criando o maior catálogo público de dados de variações e genótipos humanos. O objetivo foi encontrar a maioria das variantes genéticas com frequências de pelo menos 1% nas populações estudadas.

42 Projeto 1000 genomas

43 Projeto 1000 genomas

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45 Ensembl O Ensembl é um navegador de genomas: genômica comparativa, evolução, variação de sequências e regulação transcricional.

46 QTL Quantitative trait loci (QTLs) são regiões do genoma responsáveis pela expressão de caracteres fenotípicos, que possuem distribuição contínua Ex.: altura e peso de plantas e de animais; produção de grãos; teor de óleo etc. Os marcadores moleculares tornaram possível mapear regiões cromossômicas (QTLs) que afetam esses caracteres quantitativos. (Toledo, 2008)

47 QTL Mapear um QTL significa identificar sua posição no genoma e estimar seus efeitos genéticos, tais como: o efeito aditivo, efeito de dominância e outros efeitos presentes no modelo adotado. (Toledo, 2008)

48 QTL - exemplo A velocidade de processamento se refere à velocidade com que um indivíduo pode realizar qualquer operação cognitiva. A velocidade de processamento correlaciona-se fortemente com a capacidade cognitiva geral, diminui acentuadamente com a idade e é prejudicada em vários distúrbios neurológicos e psiquiátricos. (Knowles et al., 2018)

49 QTL - exemplo A identificação de genes que influenciam a velocidade de processamento provavelmente melhorará a compreensão da genética da inteligência, do envelhecimento biológico e das etiologias de vários distúrbios. (Knowles et al., 2018)

50 QTL - exemplo Em um estudo foram feitas análises de associação específica de ligação e QTL. A amostra incluiu 1291 indivíduos mexicanos-americanos. (Knowles et al., 2018)

51 QTL - exemplo O desempenho em todos os três fatores distintos de velocidade de processamento: (Velocidade Psicomotora; Sequenciamento e Deslocamento e Fluência Verbal) eram moderadamente e significativamente herdáveis. (Knowles et al., 2018)

52 QTL - exemplo Foi encontrado um QTL significativo no cromossomo 3q23 para a velocidade psicomotora (LOD = 4,83). Dentro desse locus, foi identificado um gene candidato plausível e interessante para a velocidade psicomotora. (Knowles et al., 2018)

53 (Knowles et al., 2018)

54 QTL - exemplo (Knowles et al., 2018)

55 QTL - exemplo O gene RASA2 (RAS p21 Protein Activator 2) é expresso no cérebro humano (cerebelo e hipotálamo). RASA2 codifica a proteína RAS que controla diversas vias de sinalização celular, incluindo crescimento, migração e adesão. (Knowles et al., 2018)

56 Referências Knowles, E., Mathias, S., Mollon, J., Rodrigue, A., Koenis, M., Dyer, T.,... Glahn, D. (2018). A QTL on chromosome 3q23 influences processing speed in humans. Genes, Brain, and Behavior, E Toledo, E. R., Leandro, R. A., Souza Junior, C. L., SOUZA, A. P. (2008). Mapeamento de QTLS : uma abordagem bayesiana. Rev. Bras. Biom., v.26, n.2, p