Marcadores de DNA são derivados de. polimorfismo entre indivíduos dentro de uma espécie.

Transcrição

1 MARCADORES MOLECULARES

2 MARCADORES MOLECULARES Marcadores de DNA são derivados de pequenas regiões do DNA que apresentam polimorfismo entre indivíduos dentro de uma espécie.

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4 Categorias de marcadores Andersen e Lubberstedt, (2003) Marcadores aleatórios (RDM-Randon DNA markers): são gerados aleatoriamente, de sítios polimórficos do genoma Marcadores gene-alvo ( GTM-gene targeted marker): são derivados de polimorfismos dentro de genes PCR-específicos ou PCR de seqüência específica Marcadores funcionais (FM-Functional markers): são derivados de sítios polimórficos dentro de genes envolvidos em determinada variação fenotípica.

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6 AVALIAÇÃO DO POLIMORFISMO DIRETAMENTE DO DNA RFLP (1980)-fragmentos de DNA de comprimento polimórfico PCR (1985)-reação de polimeraseem cadeia Mini e Microsatélites(1985)-seqüências adjacentes que se repetem em número variado RAPD (1990)-polimorfismo de DNA amplificado ao acaso AFLP (1994) -polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados SNP ( 1998) - Polimorfismos de Nucleotídeos Únicos

7 MARCADORES DE DNA RFLP Hibridização Hibridização Minisatélites ou locos VNTR RAPD SCAR Amplificação D STS do DNA (PCR) Microssatélite ou SSR AFLP SNP Seqüências ESTP Expressas ASP SNP

8 1-Extração do DNA RFLP (Botstein et al., 1980) (Identificação por hibridização do DNA) 2- Digestão por enzimas de restrição 3- Separação dos fragmentos (eletroforese) 4-Transferência do DNA para membrana de nylon 5- Hibridação (fragmentos x sondas marcadas) 6-Autoradiografia(exposição da memb. a filme de raio X ou compostos luminescentes 7- Análise da segregação

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10 RFLP (polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição).

11 Seqüência de DNA HIBRIDIZAÇÃO A T G C T C G A C G T TC G A C T TA G C C T G C A AG C T Seqüência da Sonda: (1000 pbtratadas com P 32 )

12 Marcadores RFLP

13 Usos marcadores RFLP Diversidade genética e identificação de cultivares( café, arroz, soja, milho, cana), sorgo. Construção de mapas de ligação e mapeamento de QTLs ( sorgo,café,milho cana,arroz). Seleção assistida por marcadores (SAM) (milho).

14 VANTAGENS RFLP Cobre potencialmente todo o genoma(detecta variações em seqüências de DNA de 4 a 8 pb) Expressão co-dominante Alta repetibilidade e consistência LIMITAÇÕES Passos intensivos em mão de obra Inexistência de biblioteca de sondas disponível Instalações

15 Marcadores baseados na amplificação do DNA (PCR) Aleatórios: RAPD Microssatelites ou SSR e variaçoes AFLP SNP PCR-especificos(baseado na conversão): STS Scars CAPS

16 Técnica de PCR Reação em Cadeia de Polimerase Técnica que replica milhões de vezes um fragmento de DNA, possibilitando a sua detecção e análise Extração do DNA Vários protocolos Kits prontos

17 RAPD- Fragmentos de DNA amplificados ao acaso ( Williams et al, 1990) Marcadores moleculares anônimos distribuídos pelo genoma; Utiliza primers curtos e de seqüências arbitrárias, com seqüências alvo desconhecida; Utilizaum primer único; Detectapolimorfismo emapenasumpardebases; Baseia-senaamplificaçãodeDNA; NãoPermitedistinguirheterozigotos.

18 RAPD Polimorfismo de DNA Amplificado ao acaso( Williams et al, 1990) Oligonucleotídeo (primer) + DNA genômico taq polimerase Mistura: condições cíclicas de temperatura 94 o -desnaturação do DNA 36 o -anelamento 72 o -extensão (DNA polimerase) Geração de fragmentos DNA polimórficos em grande quantidade

19 Esquema representando resultados imaginários de RAPD para 10 isolados de Leishmania chagasi. É possível agrupar os isolados de cão e de homem num único grupo (colunas a -c, i,j), que difere do grupo de isolados de raposa (faltam as bandas 1 e 3 e há uma nova banda 2 e do grupo de isolados de marsupiais (f-h), que tem menos duas bandas no padrão RAPD. As cores são apenas ilustrativas.

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21 OP-B04 OP-B07 OP-B OP-B OP-C14 Produtos de amplificação de DNA obtidos com os iniciadores OP-B04, OP-B07, OP-B08, OP- B11 e OP- C14. As colunas de 1 a 6 correspondem aos produtos de amplificação das cultivares defeijãocarioca,cariocamg,aporé,pérola,iapar57eiapar81.assetasindicamasbandas consideradas robustas.

22 RAPD Mossoró, Quitéria,Chonan,Caçador,Amarante,Amarante L,Chonan L Identificação de cultivares

23 RAPD MELÃO (Diversidade genética)

24 MELÃO

25 RAPD MELÃO Açúcares

26 Berinjela (Fitoplasma)RAPD Diagnóstico

27 RAPD VANTAGENS Simplicidade, rapidez e baixo custo Não requer biblioteca de sondas LIMITAÇÕES Expressão dominante Baixo conteúdo de informação por bloco Padronização de condições de amplificação Competição entre sítios de amplificação

28 MICROSSATÉLITES (Litt Litt & Luty, 1989) 1 a 6 nucleotídeos repetidos n vezes Freqüência de ocorrência 1 microssatelite a cada 6-7 Kb (EST) Cardle et al, 2000 Variação quanto a classe (di,tri tetra) Freqüência em plantas. (AT)n, (A)n e (AG)n(ATA)n, (AAC)n, (AGC)n, (AAG)n, (AATT)n, (AAAT)n e (ACTC)n

29 MÉTODO as sequencias que flanqueiam Regiões repetidas são amplificadas por um par de primers específicos (20 a 30 bases)- complementares as seqüências microssatélites. Cada microssatélite é um loco genético altamente variável, multialélico Separação por eletroforese (cada banda representa um alelo diferente do mesmo loco)

30 Marcadores baseados em PCR-Microssatélites AT AT AT são multi-alélicos AT AT CA CA CA CA CCG CCG CCG CCG Alelo 1 Alelo 3 Alelo 2 Alelo 5 Alelo 7 Alelo 3 CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA

31 Amplificação de microssatélites (PCR) alelo A alelo B alelo C AA AB AC BB BC CC

32 Detecção de locos SSR (PCR) CACACA GTGTGT CACACA GTGTGT (CA) 3 (CA) 3 Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3

33 CA10/CA10 CA12/CA15 CA12/CA12 CA10/CA15 CA12/CA15 CA12/CA18 CA15/CA15 CA17/CA17 CA18/CA18 CA10/CA12

34 Diversidade de Acessos de Pupunha e Banana através de Microsatélites Fenótipo eletroforético representando o polimorfismo de microssatélites com genótipos homozigotos (banda única) e heterozigotos (duas bandas), em indivíduos diplóides de Phaseolus vulgaris L.(1 a 16) e do padrão de peso molecular (M).

35 R R R R R R R R R R R R - S S S S S S S S S S S S S S S S - S S P R P S - - M Análise dos produtos de amplificação do DNA de feijão-caupi com o primer SSR VM70. PR- CNC 0434 (genitor resistente); PS- IPA 206 (genitor suscetível); R- indivíduos resistentes; S- indivíduos suscetíveis; M Marcador de peso molecular 100 pb.

36 SSR Melão virus CYSDV Diagnóstico

37 CHICORIA (SSR)

38 Similaridade Genética (Chicória)

39 Identificação de cultivares Bnlg2291 Bnlg238 M 8 3 8/ / / /4 Microssatélites de Linhagens e hibrido de milho

40 PIMENTÃO Híbridos

41 DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES DE MICROSATÉLITES DNA genômico total clivado com enzima de corte freqüente Construção de biblioteca genômica de fragmentos pequenos Triagem de colônias com sonda complementar sonda oligo (GT)n para SSR (CA) Colônias positivas seqüenciadas apenas para C e A para verificar extensão do microssatélite

42 Seleção de clones com microsatélites de pelo menos (CA) 8 com seqüências flanqueadoras adequadas Seqüenciamento completo de clones selecionados Desenho e síntese de pares de primers usando softwares específicos PCR com primers construídos para verificar nível de polimorfismo

43 DESENVOLVIMENTO DE MARCADORES DE MICROSATÉLITES A partir de Bancos de Dados Recursos Computacionais Tandem Repeats Finder versão 3.01 (BENSON, 1999) EST-SSR Pinto, 2006 Padrão de amplificação em gel de poliacrilamida 6% do SSR 18, com quatro alelos, embulks de plantas resistentes (1 a 11) e de plantas suscetíveis (12 a 21) ao bichomineiro

44 Vantagens Herança codominante; alta abundância nos genomas eucariotos; multi-alelismo; baixo custo e potencial para amplificação de sistemas multiplex; Fácil execução ; automatizável Transferibilidade

45 DESVANTAGENS Desenvolvimento dos pares de primers específicos-construção de bibliotecas genômicas enriquecidas com os microssatélites clonagem e seqüenciamento desses e o desenho dos primers complementares às regiões conservadas que flanqueiam os microssatélites

46 AFLP- Polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados (Vos et al., 1995). Técnica: Clivagem do DNA genômico com duas enzimas de restrição Ligação de adaptadores específicos aos terminais dos fragmentos clivados Pré-amplificação dos fragmentos,utiliza primersespecificospara cada adaptador mais uma base seletiva (Eco + A, M+C) Amplificação seletiva utiliza primersespecíficos para o adaptador, sitio de restrição mais três bases seletivas Eletroforese em gel de alta resolução

47 DNA Genômico + Enzimas de Restricâo Eco RI (sitio de restrição:6 a 8 pb) Mse I} (4pb) Fragmentos de DNA de variados tamanhos Ligação de adaptadores 5 TA AATTC T G AAT TTAA 5 MseI I adaptador EcoRI adaptador PCR Amplificação Pre-seletiva 5 A C 5 AFLP Marcação de primers Primers 5 AATTC TTAA G TTA AAT PCR Amplificação seletiva AAC AATTC G TTAA TTA AAT AAC 5

48 AFLP Polimorfismo

49 MARCADOR AFLP COLOR IAC-22 REDENÇÃO PRECOCE ITA-96 Tamcot SP-37 GH REDENÇÃO ITA-90 Deltapine Acala

50 AFLP

51 AFLP Brássica diversidade

52 Tomate Sacarose- AFLP

53 AFLP nabo

54 Vantagens dos marcadores AFLP: A grande quantidade de fragmentos que são gerados e resolvidos em um único gel, é o mais alto entre todas as tecnologias de marcadores. Grande poder de detecção de variabilidade genética. Da mesma forma que o ensaio de RAPD, o ensaio AFLP não requer conhecimento prévio de seqüência de DNA. Depois de preparados os fragmentos amplificáveis, um grande número de bandas polimórficas pode ser rapidamente obtido simplesmente com a variação das bases arbitrárias dos primers. O ensaio de AFLP é bem mais eficaz quando comparado ao ensaio de RAPD, pois na etapa de PCR, são utilizados primers bem mais longos, o que aumenta a especificidade da amplificação, evitando com isso a competição que ocorre durante a PCR no ensaio de RAPD.

55 Desvantagens dos marcadores AFLP: Baixo conteúdo de informação genética por loco. Marcadores AFLP são dominantes, genótipos heterozigotos não podem ser diretamente discriminados dos homozigotos. A análise de marcadores AFLP envolve um número maior de passos do que a análise de RAPD, uma maior quantidade de reagentes ( enzimas de restrição, adaptadores e primers específicos ). Um DNA de alto nível de pureza é necessário para garantir a digestão completa pelas enzimas de restrição em todas as amostras, a digestão parcial ou a má qualidade do DNA pode facilmente levar a interpretações errôneas do polimorfismo.

56 MARCADORES MOLECULARES Construção de mapas genéticos Análise da diversidade genética Mapeamento de características de interesse agronômico AVALIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DE SEQÜÊNCIAS DE DNA

57 MARCADORES MOLECULARES Acesso de regiões intergênicas Regiões que não codificam seqüências gênicas INTERESSE Marcadores para identificação de alelos específicos PCR- específicos Automatização do seqüenciamento de DNA

58 Marcadores PCR-específicos (Conversão de marcadores) Obtidos a partir de marcadores já existentes ou Sequências expressas de banco de dados Uso de primersespecíficos seqüências já mapeadas ou caracterizadas obtidos da conversão de marcadores RAPD(SCAR), RFLP(STS), AFLP, SSR Conversão: Clonagem do DNA amplificado pelo marcador Sequenciamento Desenho de primers específicos (superior a 20pares de bases) Útil na seleção assistida: resistência a doenças, cor de flor Se os primersestiverem disponíveis, as técnicas apresentam custo baixo.

59 MARCADORESDERIVADOS DE SEQÜENCIAS EXPRESSAS SNP- Polimorfismo de um nucleotídeo Single Nucleotide Polymorphism ou Polimorfismos de Nucleotídeos Únicos Polimorfismo baseados na alteração de uma única base no genoma Exemplo: AAGGTTA muda para ATGGTTA. Tipos mais comuns de SNPs: Transição: base puricaé substituída por outra púrica A-T, G-C Transversão: púrica substituída por pirimídica ou vice-versa : A-C, G-T, A-C e C-T

60 Podem ocorrer em regiões expressas e não expressas São estáveis do ponto de vista evolutivo SNP se ocorrer em pelo menos 1% da população Alta freqüência e distribuição no genoma: Genoma humano: 90% polimorfismo SNPs 1,42 milhão Milho:1SNP 48pb (Regiões não-codificadoras) Total SNPs São encontrados no genoma em : Haplogrupos: mutações que ocorrem próximas e são herdadas juntas Indivíduo Seqüência encontrada Haplogrupo 1 GATATTCGTACGGATGTATC AG 2 GATGTTCGTACTGATGTATC GT Individuais: 1SNP 131 pb (Regiões codificadoras) Barker, 2002

61 Métodos para detectar SNPs SNPs não necessitam da separação de fragmentos de DNA por tamanho Sequenciamentode segmentos amplificados via PCR de indivíduos diferentes Descoberta de SNPs em bibliotecas genômicas(snp Finder) Descoberta de esnp em bibliotecas de EST São encontrados em: 1. Em regiões codificadoras: podem gerar alelos 2. Em regiões não codificadoras: servem como marcadores moleculares.

62 VANTAGENS Abundância no genoma Elevado grau de polimorfismo Detecção de diferentes alelos para genes de interesse DESVANTAGEM Seqüenciamento de DNA em grande escala

63 Aplicações Construção de mapas genéticos Mapeamento de características de interesse Análise de populações Identificação de cultivares

64 ESTP Expressed Sequence Tag Polymorphisms Polimorfismo de seqüência Expressa Marcada Seqüência de DNA para genes expressos Desenvolvimento de marcadores baseados na seqüência de genes Teste em diferentes genótipos Podem ser identificadas ainda: Microarray SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) Diferentialdisplay

65 ASP Allele Specific Polymorphism Polimorfismo Alelo Específico Trabalha-se com a seqüência do gene Identificação de plantas variantes alélicos de um gene Eventos de Inserção / Deleção / Substituição de base na região transcrita de um gene

66 Desenvolvimento Identificação e seqüenciamento dos variantes alélicos do gene de interesse Desenho de um par de primers Anelamento local de inserção / deleção / substituição

67 Uso de técnica PCR para a detecção de OGM.

68 Técnica de PCR PCR Qualitativo detectar (screening) identificar (específico) Sistema PCR screening Ex.: Detecta Segmento comum às construções gênicas Soja RR: CaMV 35S Promoter CP4 EPSPS Petunia CTP NOS Terminator

69 Sistema PCR screening Método de Rotina Problemas Falso positivo Presença natural da sequência alvo Família Cruciferae DETECÇÃO DE COMPONENTES GENETICAMENTE MODIFICADOS EM PLANTAS E DERIVADOS

70 Sistema PCR específico Detectar e identificar OGMs Amplifica região específica do evento Ex.: Soja RR: CaMV 35S Promoter CP4 EPSPS Petunia CTP NOS Terminator DETECÇÃO DE COMPONENTES GENETICAMENTE MODIFICADOS EM PLANTAS E DERIVADOS

71 Sistema PCR específico Necessário conhecer a seqüência alvo Problemas Obtenção de seqüências PCR Multiplex Banco de dados Amplifica múltiplas seqüências alvo Utiliza combinação de primers Identificados simultaneamente quatro eventos DETECÇÃO DE COMPONENTES GENETICAMENTE MODIFICADOS EM PLANTAS E DERIVADOS

72 PCR Quantitativo PCR Semi quantitativo Amplificação DNA alvo Comparação visual com DNA padrão Resultado em faixas Detecta a partir de 1% de OGM DETECÇÃO DE COMPONENTES GENETICAMENTE MODIFICADOS EM PLANTAS E DERIVADOS

73 PCR Quantitativo PCR competitivo -Visa a padronização do teste de PCR - Padrão interno de DNA DNA competitivo - Amplifica DNA alvo e competitivo - Geram bandas distintas DETECÇÃO DE COMPONENTES GENETICAMENTE MODIFICADOS EM PLANTAS E DERIVADOS

74 Princípio DNA competitivo Primer 1 Primer 2 DNA fragment of transgenic soy Amostra: 35S-Promotor NOS Padrão Interno: Artificially produced, shortened DNA fragment Primer 1 Primer 2 DETECÇÃO DE COMPONENTES GENETICAMENTE MODIFICADOS EM PLANTAS E DERIVADOS

75 PCR real time - Amplificação e quantificação simultânea -Utiliza dois primers e uma sonda DETECÇÃO DE COMPONENTES GENETICAMENTE MODIFICADOS EM PLANTAS E DERIVADOS

76 PCR real time 1. Anelamento específico - sonda e primer 2. Extensão do primer e hidrólise da sonda 3. Liberação da sonda 4. Sinal aumenta em proporção ao número de ciclos DETECÇÃO DE COMPONENTES GENETICAMENTE MODIFICADOS EM PLANTAS E DERIVADOS

77 PCR real time PCR-Cycles DETECÇÃO DE COMPONENTES GENETICAMENTE MODIFICADOS EM PLANTAS E DERIVADOS

78 PCR real time GMO DNA Detection ntensity Fluorescence In 15,0 % 20 2,0 % 0,5 % ,1 % Cycle Number DETECÇÃO DE COMPONENTES GENETICAMENTE MODIFICADOS EM PLANTAS E DERIVADOS

79 Considerações sobre PCR Vantagens sensibilidade detectar, identificar e quantificar estáveis Desvantagens custo ($75-300) equipamentos sofisticados mão obra especializada DETECÇÃO DE COMPONENTES GENETICAMENTE MODIFICADOS EM PLANTAS E DERIVADOS