Melhoramento Genético de Plantas

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1 Melhoramento Genético de Plantas Prof. Dr. Natal A. Vello Doutoranda Fernanda A. Castro Pereira

2 Genética Mendeliana Genética Quantitativa Estatística Melhoramento genético convencional Biotecnologia

3 Biotecnologia cultivo in vitro micropropagação técnicas moleculares biologia molecular As bases fundamentais da biotecnologia agrícola consideram a biologia molecular e as técnicas relacionadas como os eventos mais importantes da história da biotecnologia. Biologia molecular Técnicas moleculares Marcadores moleculares Transformação genética Etc...

4 Biologia molecular: Análise dos indivíduos com base no seu DNA

5 Tipos de marcadores Marcadores fenotípicos Características do organismo - Ex.: cor da flor de soja Marcadores bioquímicos Presença ou ausência de compostos Ex.: isoenzimas, proteínas ou polissacarídeos específicos. Marcadores moleculares Presença ou ausência de sequências de DNA ou RNA - Ex. genes ou regiões não-codificantes - alteração em uma ou mais bases nitrogenadas

6 Marcadores Moleculares

7 Marcadores Moleculares Conceito: Marcadores de DNA são derivados de pequenas regiões do DNA que apresentam polimorfismo entre indivíduos dentro de uma espécie. p.ex.: Marcadores flaqueando um gene/qtl importante Marcadores genéticos, quando associados a características de interesse (QTLs), aumentam a eficiência de seleção

8 CONCEITOS PCR Polimerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase) Amplificação de um fragmento de DNA sem o uso de um organismo vivo. O processo consiste basicamente em utilizar os mecanismos da replicação in vitro

9

10 TERMOCICLADOR 94 a 96 C - separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação, quebra das pontes de hidrogênio). 50 a 60 C - Anelamento dos primers com a fita molde de DNA 72 C - Extensão da nova molécula - Taq Polimerase Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial 2 n

11

12 O resultado é analisado por meio de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida

13 O DNA pode ser visualizado usando-se o brometo de etídio, que, quando intercalado no DNA, fica fluorescente sob a luz ultravioleta.

14 Considerando: O marcador associado ao gene de resistência R, é possível observar que esse marcador consegue amplificar o gene R. No indivíduo suscetível, onde não existe o gene R, não houve amplificação, portanto ausência de marca. S R DNA da planta resistente DNA da planta suscetível Padrão de banda polimórfica

15 PCR em tempo real Método atual de aferir o nível de expressão dos genes; Técnica quantitativa: consegue quantificar o n de moléculas produzidas ciclo a ciclo. n ciclos 2 n quantidade de DNA

16 Tipos de Marcadores RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RAPD Random Amplified Polymorphic DNA MICROSSATÉLITES SSR Simple Sequence Repeats AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism SNP marcadores derivados de sequencias expressas

17 Exemplos Estudo de diversidade genética Acessos de melão Ritschel et al. BMC Plant Biology :9 doi: /

18 Seleção de plantas zigóticas na população LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.1, p , 2001 Amplificação do DNA com primers SSR (1) - limão Cravo (Citrus limonia Osbeck) (2) - laranja Caipira (Citrus sinensis (L.) Osbeck) (3, 6, 7, 8 e 9) - híbridos

19 Escolha dos Genitores Caracterização de linhagens de milho em grupos heteróticos CELSO GONÇALVES DE AGUIAR - Tese (DETERMINAÇÃO DE GRUPOS HETERÓTICOS EM MILHO UTILIZANDO MARCADORES MOLECULARES E CRUZAMENTOS TESTE ) MARINGÁ PARANÁ

20 Seleção assitida por marcadores (SAM) Inoculação do patógeno Seleção de indivíduos resistentes e suscetíveis Bulk R e Bulk S Seleção de marcadores polimórficos ligado a região do genoma que participa no processo de defesa da planta contra a doença. Summa Phytopathol, Botucatu, v. 34, n. 3, p , 2008 Ferrugem em eucalipto

21 Transformação de Plantas

22

23 3 etapas 1 Métodos de inserção do DNA INDIRETO Via Agrobacterium DIRETO Biobalística Eletroporação recombinante

24 Transformação por Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens galha da coroa Bactérias do solo que tem a capacidade de transferir parte do seu DNA para dentro da célula da planta

25 Construção plasmidial contendo o gene de interesse

26 No laboratório, a bactéria é colocada em cultura junto com as células de plantas, transferindo parte do seu DNA para as células da planta

27 Transformação por Biobalística Partículas de ouro ou tungstênio são cobertas com DNA e aceleradas em direção ao tecido da planta

28

29 Transformação por eletroporação Consiste em submeter os protoplastos e DNA a um campo elétrico de intensidade controlada Choque elétrico - formação de poros reversíveis na membrana plasmática permitindo a entrada do DNA.

30

31 Alta voltagem

32 2 Regeneração (Cultura de tecidos) Totipotência - é a capacidade de regenerar um indivíduo completo a partir de uma única célula. Essa propriedade não é constatada nas células animais.

33 3 Análises Moleculares de Plantas Transgenicas O gene de interesse é transferido juntamente com o gene marcador de seleção Southern blot detectar fragmentos de DNA específicos. PCR alta sensibilidade, o que leva a resultados de falso positivo.

34 Os Transgênicos

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37 Tipos de Transgênicos 1ª Geração Características de produção redução do custo de produção 2ª Geração resistência a herbicida, doenças e insetos tolerância ao estresse ambiental 3ª Geração Características de consumo agregar valor ao produto final melhoria nutricional melhor conservação pós-colheita Os campos vão se transformar em fábricas de proteínas e medicamentos BASF

38 Soja transgênica - 1ª Geração Roundup Ready - soja tolerante ao herbicida glifosato Glifosato bloqueia a atividade da enzima EPSPS Gene CP4 EPSPS (transgene) Aprovada pela CTNBio em 2005 Atualmente:

39 Cultivance e é o primeiro material geneticamente modificado, desenvolvido no Brasil, desde o laboratório até a comercialização. Soja resistente ao herbicida de amplo espectro da BASF + EMBRAPA. Aprovado pela CTNBio em 2009

40 Soja transgênica - 2ª Geração Produtividade Lagarta-da-soja, Lagarta-da-maçã, Falsa- Medideira e Broca-das-axilas. Tolerância à aplicação de glifosato RR X Intacta sem inseticida

41 Transgênicos (Soja e Milho) - 3ª Geração em fase de desenvolvimento Soja com mais ácido oleico Soja com alto conteúdo de isoflavonóides Soja com ácido linolênico conjugado Soja com teor elevado de ômega 3 Plantas de milho que sintetizam genes do hormônio do crescimento humano.

42 Embrapa Alface transgênica 3ª geração: 30% a mais de ácido fólico

43 Últimas notícias 05/2016 Academia de Ciências dos EUA afirma que alimentos transgênicos são seguros 04/2016 Brasil apresenta crescimento da adoção de transgênicos

44 Desafios da Biotecnologia no Melhoramento de Plantas Natureza poligênica das características de importância econômica Interação do genótipo com o ambiente (F = G + A) Novas tecnologias desenvolvidas com a biotecnologia

45 Biblioteca Central ESALQ/USP

46 OBRIGADA

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