IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS POR HIBRIDIZAÇÃO E SEQUENCIAMENTO. Aula 5. Maria Carolina Quecine Departamento de Genética

Transcrição

1 IDENTIFICAÇÃO DE SEQUÊNCIAS POR HIBRIDIZAÇÃO E SEQUENCIAMENTO Aula 5 LGN232 Genética Molecular Maria Carolina Quecine Departamento de Genética mquecine@usp.br

2 LEMBRANDO O DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR Genoma Transcriptoma Proteoma

3 Como conhecer as sequências presentes em um genoma e/ou quais estão sendo expressas (RNA e proteínas)? Hibridização com sondas conhecidas; Sequenciamento.

4 Técnicas de Blotting Southern blot diz respeito a uma técnica utilizada na Biologia Molecular através da qual é possível verificar se uma sequência de DNA específica (gene de interesse) está ou não presente na amostra em análise que contem uma mistura complexa (genoma inteiro de um organismo). Northern Blot é uma técnica usada na pesquisa em biologia molecular para estudar a expressão gênica, ou seja, verificar se um determinado gene de um genoma é ou não transcrito em RNA e quantificar isso. Essa técnica tem tal nome devido à similaridade de seu procedimento com o Southern blot (batizada pelo biólogo britânico Edwin Southern; com a diferença chave de que, em vez de DNA, a substância analisada por eletroforese com uma sonda hibridizadora é RNA). Western blot é um método em biologia molecular e bioquímica para detectar proteínas em um homogenato (células bem trituradas) ou um extrato de um tecido biológico. Essa técnica usa eletroforese em gel para separar as proteínas desnaturadas por massa.

5 O Southern Blot

6 O Northern Blot

7 O Western Blot

8 LIMITAÇÕES DAS TÉCNICAS Qualitativa ou semi-quantitativa; Uma sonda utilizada por vez; Depende de uma sequência conhecida previamente (sonda); Ainda MUITO utilizadas para confirmação de trasngênicos, validação de dados de transcriptômicas proteômicas!

9 E agora, como obter as sequências??

10 TECNOLOGIAS PARA O SEQUENCIAMENTO Método Maxam & Gilbert (1977)* - Método dedegradação química DE DNA Tecnologias de primeira geração: Método Sanger (1977) - Método enzimático, dideoxi oudetérmino dacadeia - Síntese enzimática de uma fita complementar de DNA, cujo crescimento é interrompido pela adição de um dideoxinucleotídeo (ddntp) Prêmio Nobel em Química (1980) Frederick Sanger *Produtos tóxicos e perigosos à saúde, além da dificuldade de automatização, essencial para o sequenciamento de um genoma completo.

11 ETAPAS DO SEQUENCIAMENTO DE DNA Preparação do DNA Reação de sequenciamento Eletroforese capilar Análise computacional

12 PREPARAÇÃO DO DNA CÉLULA MEMBRANA PLASMÁTICA E PAREDE CELULAR PURIFICAÇÃO DO DNA TOTAL SEPARAÇÃO DOS RESTOS CELULARES

13 5 Bases Fosfato 2-deoxyribose Ribose Açúcar 3 OH Ligação fosfodiester 3 OH

14 DESOXIRIBOSE RIBOSE DIDESOXIRIBOSE

15 NUCLEOTÍDEOS dntps NUCLEOTÍDEOS ddntps (TERMINADORES) FALTA 3 OH CORANTE FLUORESCENTE

16 REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO

17 DNA polimerase Terminadores Nucleotídeos

18 DESNATURAÇÃO DO DNA calor FITA COMPLEMENTAR FITA MOLDE

19 ANELAMENTO DOS PRIMERS PRIMER FITA COMPLEMENTAR FITA MOLDE

20 ANELAMENTO DOS PRIMERS FITA COMPLEMENTAR PRIMER FITA MOLDE

21 DNA POLIMERASE PRIMER FITA MOLDE

22 PRIMER POLIMERIZAÇÃO FITA MOLDE PRIMER DNA POLIMERASE FITA MOLDE PRIMER DNA POLIMERASE FITA MOLDE

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29 TERMINAÇÃO ddgtp ddatp ddttp PRIMER FITA MOLDE ddgtp ddatp ddttp ddctp

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31 ELETROFORESE CAPILAR ABI 3700 Applied Biosystems

32 - Eletroforese capilar +

33 LASER

34 LASER LASER

35 Detecção a laser

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37 ANÁLISE COMPUTACIONAL

38 FRAGMENTOS DE DNA SEQUENCIADOS FRAGMENTOS COMPLETOS

39 Biblioteca de insertos pequenos Montagem dos fragmentos Fechamento dos gaps Análise

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41 Tecnologia de primeira geração Tecnologias de segunda geração

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43 O SEQUENCIAMENTO DE PROTEÍNAS É BEM MAIS COMPLEXO!!!!

44 ANIMAÇÕES

45 ESTUDO DIRIGIDO 1. Conceito dos diferentes blottings ; 2. Sequencimento por Sanger; 3. Novas técnicas de sequenciamento (LER o texto Sequenciamento de nova geração