Aplicações de anticorpos em métodos diagnósticos

Transcrição

1 Aula Prática Demonstrativa: Aplicações de anticorpos em métodos diagnósticos Introdução Profa. Cristina MED- 2017

2 Detecção de anticorpos (diagnóstico sorológico) Exemplo: detecção de anticorpos em jovem mulher grávida, específicos para o vírus da rubéola Titulação de anticorpos séricos Detecção de anticorpos de isotipo IgM e IgG Lembrar que o conceito referente ao isotipo de imunoglobulina predominante nas respostas primária e secundária frente ao antígeno viral pode ajudar a investigar se a infecção é recente ou antiga

3 Detecção de antígenos no soro de pacientes Exemplo: antígeno Hbs circulante em pacientes com hepatite B Para a detecção de antígeno é necessário dispor de anticorpos específicos para esse antígeno, produzidos em espécie diferente da humana (anticorpos heterólogos). Monitoramento regular dos níveis de antigenemia permite acompanhar a evolução da doença em pacientes acometidos.

4 Perguntas Como obter o anticorpo heterólogo específico para o antígeno Hbs? Como visualizar a ocorrência de interações antígeno-anticorpo?

5 Imunização antígeno Memória Célula B antígeno Plasmócito Produção de imunoglobulinas

6 Como detectar a ocorrência de interação entre o antígeno e o anticorpo? Reações com antígenos particulados podem ser visíveis a olho nu ou com lentes de aumento Anticorpos aglutinam bactérias Exemplo: Reação de Widal para o diagnóstico da febre tifóide

7 A marcação do anticorpo pode tornar perceptível uma interação que passaria depercebida Enzima Produto Substrato antígeno Exemplo: conjugação do anticorpo a uma enzima que ao agir sobre um substrato gera cor.

8 Módulos demonstrativos Produção de anticorpos Aglutinação ELISA Immunoblot BOM TRABALHO!!!

9 Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular Produção de Anticorpos Flávia C. Mendonça Natividade, Ma. Ribeirão Preto, 03 de fevereiro de 2017

10 Como escolher anticorpos para serem utilizados no experimento? Qual será a aplicação? Western blot ELISA Reação de aglutinação

11 Como escolher anticorpos para serem utilizados no experimento? Qual a natureza da amostra? Imunógenos podem ser: proteína, fragmentos da proteína, peptídeos, organismos (ex: bactérias, vírus), etc.

12 Onde vou produzir anticorpos?

13 Primary Antibodies

14 Produção de anticorpos policlonais - Técnica IgY

15 Aglutinação

16 Dr. Karl Landsteiner Nobel de Medicina de 1930

17 Hemaglutinação Direta Exemplo: Tipagem sanguínea

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21 Digestão enzimática de Ab Ambas induzem Aglutinação?

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23 Aula prática demonstrativa Aplicações de anticorpos em métodos diagnósticos ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay MSc. Bruna Bertol

24 ELISA Conceito e características da técnica Eva Engvall e Peter Perlmann, 1971 Um imunoensaio que permite a detecção e quantificação de anticorpos/antígenos específicos em uma amostra por meio de uma molécula indicadora - enzima. Baseia-se nas interações antígeno-anticorpo altamente específicas. Resultado final é um produto solúvel corado passível de quantificação Importante ferramenta de pesquisa e diagnóstico clínico Alta especificidade e sensibilidade

25 ELISA Equipamentos e materiais necessários Placas Pipetas automáticas Lavadora de ELISA Leitora de ELISA

26 ELISA Tipos de ELISA ELISA indireto - Detecção de anticorpos - Exemplo: HIV (1ª e 2ª geração) e doença de chagas

27 ELISA Tipos de ELISA ELISA sanduíche - Detecção de antígenos - Exemplo: Hepatite B (HBsAg), HIV (3ª e 4ª geração)

28 ELISA Tipos de ELISA ELISA competitivo - Detecção de antígenos de baixo peso molecular - Exemplo: T3, T4, progesterona; pesquisa de aflatoxina em alimentos

29 ELISA ELISA captura de IgM Tipos de ELISA Substract Signal - Diagnóstico de infecções de fase aguda/recentes - Exemplo: Hepatite B (anti-hbc IgM), dengue

30 ELISA Resultados do ensaio Qualitativo: Interpretação visual (sim ou não, positivo ou negativo) Quantitativo: Dosagem em função de uma curva-padrão Diluição do Ag/Ac em concentrações conhecidas EXEMPLO A intensidade de cor é diretamente proporcional a quantidade de antígeno/anticorpo presente na amostra (exceto no ensaio de ELISA por competição)

31 Vídeo demonstrativo

32 AULA PRÁTICA WESTERN BLOT Msc. Sandra Palma Albornoz

33 WESTERN BLOTTING Blot = do inglês manchar Western Edwin Southern (Detecção de DNA) Detectar a presença de uma determinada proteína em uma amostra e estimar sua quantidade. * Serve como teste confirmatório dos resultados imunoenzimaticos

34 Princípio da técnica Detectar o Ag de interesse pelo reconhecimento de epitopos lineares deste Ag por anticorpos específicos B C Anticorpo A: reconhece epitopo linear Anticorpo B: reconhece epitopo conformacional Anticorpo C: reconhece epitopo linear

35 Preparação da amostra Desnaturação das proteínas Tratamento do Dodecil-sulfato de sódio (SDS) Agente desnaturante Antes do SDS Aminoácidos carregados Aminoácidos hidrofóbicos Depois do SDS

36 Dodecil-sulfato de sódio (SDS) Antígeno desnaturado Apenas epitopos lineares são reconhecidos pelos anticorpos

37 Etapas da técnica Amostra de antígenos Transferência para Membrana (nitrocelulose) Gel de separação Ac primario específico Ac marcado Detecção do Ag-Ab com Ac secundário Visualização das bandas marcadas

38 1º Passo: Separação das moléculas por eletroforese Amostra de antígenos Transferência para Membrana (nitrocelulose) Gel de separação AC primario específico Ac marcado Detecção do Ag-Ab com Ac secundário Visualização das bandas marcadas

39 Eletroforese Amostra com Proteínas desnaturadas (SDS-B mercaptoetanol) Amostras coradas Migração de moléculas Polo -para polo + Separação por tamanho

40 Gel da Eletroforese

41 2º Passo: Transferência das proteínas do gel para a membrana Amostra de antígenos Transferência para Membrana (nitrocelulose) Gel de separação Ac primario específico Ac marcado Detecção do Ag-Ab com Ac secundário Visualização das Visualização bandas marcadas das bandas marcadas

42 2º Passo: Transferência das proteínas do gel para a membrana - Migração Gel Membrana +

43 3º Passo: Detecção da proteína de interesse com Acs específicos e Reconhecimento de Ag-Ac pelo Ac secundário. AC primario Detecção do Ag-Ab com Ac secundário Visualização das bandas marcadas

44 Detecção de anticorpos específicos

45 Análise do Western blot Diagnóstico de HIV Pacientes