IMUNO ENSAIOS USANDO CONJUGADOS

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1 IMUNO ENSAIOS USANDO CONJUGADOS

2 REAÇÕES USANDO REAGENTES MARCADOS Conjugado: molécula constituída por duas substâncias ligadas covalentemente e que mantêm as propriedades funcionais de ambas Ex: globulina de carneiro anti IgG humana marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) HRP: enzima peroxidase

3

4 IMUNO ENSAIOS UTILIZANDO CONJUGADOS Antígenos usados nos imuno ensaios: patógeno inteiro, moléculas derivadas de patógenos, hormônios Anticorpos usados: policlonais ou monoclonais Ensaios manuais e automatizados

5 TÉCNICAS

6 1 TÉCNICAS QUE USAM FLUORESCÊNCIA Fluorescência: emissão de luz de uma cor após irradiação com luz de cor diferente: FITC: absorção máxima ( nm), emissão máxima (517 nm) Técnicas: imunofluorescência, citometria de fluxo

7 Alguns fluorocromos FITC: isotiocianato de fluoresceína PE: ficoeritrina Rodamina

8 IMUNOFLUORESCÊNCIA Lâmina de imunofluorescência Antígeno usado: pode-se usar Ag comercial ou pesquisar Ag (micróbio) num material coletado do paciente (ex: secreção) Exemplo: IMUNOCRUZI : Ag de Trypanosoma cruzi liofilizado obtido por cultivo em meio de LIT

9 CONJUGADO E MONTAGEM DA LÂMINA Antissoro (anti IgG ou anti IgM): gama globulina obtida em espécie heteróloga (carneiro, cabra) purificada e conjugada marcada - com substância fluorescente (fluorocromo) Intensidade da luz emitida depende do ph (ao final, lâmina é coberta com glicerina de alcalina e lamínula

10 KIT COMPLETO PARA IMUNOFLUORESCÊNCIA

11 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA I - Reação de imunofluorescência direta (RIFD) pesquisa do Ag em células ou tecidos elevada sensibilidade e especificidade Usa um conjugado para cada sistema

12 Reação de imunofluorescência

13 II - Reação de imunofluorescência indireta (RIFI) amplificação do sinal aumento da sensibilidade em relação à RIFD A - pesquisa de antígeno mais sensível, uso de um único conjugado para diferentes sistemas

14 Reação de imunofluorescência

15 Reação de imunofluorescência indireta (RIFI) B - pesquisa de anticorpo contra um agente infeccioso Ag do agente infeccioso (lâmina) + soro do paciente Ag-Ac LAVAR Ag-Ac + conjugado anti-igg ou anti IgM microscópio

16 RIFI PARA PESQUISA DE ANTICORPO ANTI TOXOPLASMA GONDII NO SORO DO PACIENTE

17 RIFI PARA ANTICORPO SÉRICO ANTI LEISHMANIA

18 DETERMINAÇÃO DA CLASSE DO AC Uso de conjugado contra a classe de Ig que se quer determinar: Ex. de conjugado: globulina de carneiro anti IgG humana marcada pelo FITC

19 DETERMINAÇÃO DO TÍTULO DE ANTICORPO Como o resultado é liberado: Toxoplasmose IgG (imunofluorescência): Resultado: reagente (ou positivo até) 1:8.192

20 INTERFERENTES NA PESQUISA DE IgM POR RIFI Presença de fator reumatóide (FR) falsopositivo: o Competição com IgG falso-negativo Para eliminar falso positivo e falso negativo: Usar o Removedor IgG/FR: soro do paciente + soro com anti IgG humano seguido de centrifugação usar sobrenadante para dosagem de IgM

21 KIT PARA IMUNOFLUORESCÊNCIA PARA AC ANTI TRYPANOSOMA CRUZI

22 Desvantagens da RIFI: Mais demorada, maior número de reagentes Limitações da reação de imunofluorescência Necessidade de microscópio de fluorescência, subjetividade, não automação

23 AUTOMAÇÃO NA IMUNOFLUORESCÊNCIA (E ELISA)

24

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26 REAÇÕES DE ENZIMAIMUNOENSAIO Reação Ag-Ac monitorada por medida da atividade enzimática Alta sensibilidade, reagentes estáveis, leitura visual ou fotométrica, substratos coloridos ou luminescentes

27 CLASSIFICAÇÃO DOS ENZIMA- IMUNOENSAIOS Ensaios homogêneos: atividade da enzima é alterada como parte da atividade imunológica, não precisa de lavagem entre as etapas Ensaios heterogêneos: atividade da enzima não é alterada, precisa de lavagem entre as etapas

28 ENZIMA IMUNOENSAIO HOMOGÊNEO SLFIA (substrate-labelled fluorescent immunoassay) A atividade da enzima é alterada pela ligação do Ac ao substrato fluorogênico

29 ENSAIOS HETEROGÊNEOS I - ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) Uso de peptídeos sintéticos ou recombinantes e de anticorpos monoclonais Fase sólida: placas de poliestireno Material da placa tem afinidade por proteína Interação proteína-placa é não covalente

30 PLACAS E TIRAS PARA ELISA

31 ETAPAS DO ELISA sensibilização (ou cobertura) da fase sólida: adição de Ag do agente infeccioso (ou de Ac contra o que se quer pesquisar) Bloqueio: adição de proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado lavagens

32 ETAPAS DO ELISA adição da amostra do paciente (soro) na qual se deseja pesquisar Ag ou Ac em diluente * adição do conjugado: anticorpo marcado com enzima (ex: peroxidase) lavagens

33 ETAPAS DO ELISA o Adição do substrato cromogênico: peroxidase: H 2 O 2 (substrato) + OPD (ortofenilenodiamina) ou ABTS (ácido 5-amino salicílico) (cromógenos)

34 ETAPAS DO ELISA Interrupção da reação: adição de SDS ou H 2 SO 4

35 Leitura do resultado Leitor de ELISA: Fotômetro multicanal para tiras ou placas Filtros: 405, 450, 490, 630 nm Leitura monocromática: uso do comprimento de onda no qual o produto da reação tem maior absorbância Leitura bicromática ou diferencial: uso de 2 filtros: o primário e o diferencial Elimina imperfeições do plástico Leitura é feita usando os 2 filtros, o aparelho libera a diferença das 2 absorbâncias

36 EXPRESSÃO DOS RESULTADOS limiar de reatividade (cut-off): ponto de corte de um teste sorológico; pode-se trabalhar com maior especificidade ou sensibilidade dependendo do objetivo do teste (ex: seleção de doadores num banco de sangue)

37 Cut-off (limiar de reatividade) Corrigir: b: máxima sensibilidade e especificidade g: máxima especificidade

38 Leitor de ELISA

39 Reação de ELISA Lavadora de placas Pipeta multicanal

40 ELISA: ENSAIOS PARA ANTICORPOS

41 ELISA: ENSAIOS PARA ANTÍGENOS

42 II - Western Blot Pesquisa de antígenos e anticorpos Exemplos: - Caracterizar reatividade sérica de paciente suspeito de infecção pelo HIV (teste confirmatório para infecção pelo HIV)

43 II - WESTERN BLOT Western blot para pesquisa de Ac anti HIV: Fracionamento das proteínas do HIV: separação de acordo com peso molecular Transferência das proteínas para membrana de nitrocelulose Em seguida, etapas semelhantes ao ELISA: nesse caso pesquisa-se quais proteínas do HIV o soro reconhece Cromógeno usado deve originar produto insolúvel

44 Western blot

45 Western Blot

46 ONDE ESTUDAR Imunoensaios Fundamentos e Aplicações. VAZ, TAKEI, BUENO, 1ª edição, 2007 OU Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Auto-Imunes FERREIRA & ÁVILA, 2 a edição, OU Imunologia Médica - PARSLOW, 10 a edição, OU Imunologia Clínica na Prática Médica VOLTARELLI, DONADI, CARVALHO, ARRUDA, LOUZADA JR, SARTI, 1ª edição, 2008.

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