Imunoensaios no laboratório clínico

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1 Imunoensaios no laboratório clínico

2 Onde pesquisamos Ag e Ac??

3 Imunoensaios detecção e quantificação de antígeno e anticorpo: Doenças infecciosas: diagnóstico da doença diferenciação da fase da doença Presença de IgM sugere infecção recente avaliação de prognóstico avaliação de cura (no caso da hepatite B) dosagem de hormônios (T3, TSH, b-hcg) Determinação de grupo sanguíneo (sistema ABO e Rh)

4 Perfil de anticorpos (IgM e IgG) na rubéola pós natal IgM residual: IgM presente vários meses (até 2 anos) após início da infecção. Não está relacionado com infecção recente Gestante com IgM positivo: pedir teste de avidez de IgG

5 Perfil de anticorpos na rubéola pré-natal Diagnóstico de infecção no feto ou recém nascido feito pela presença de IgM

6 Marcadores sorológicos na hepatite B Vírus da hepatite B (VHB ou HBV) HBsAg: Ag de superfície do HBV - Presença no soro permite definir o agente infeccioso que provoca a hepatite - usado na vacina anti-hbv

7 Acompanhamento da hepatite B

8 Imunoensaios Técnicas com reagentes não marcados: aglutinação de hemácias, aglutinação de partículas de látex Técnicas com reagentes marcados: imunofluorescência, ELISA, citometria de fluxo

9 Sensibilidade analítica É a menor quantidade do elemento em análise que o teste é capaz de detectar Exemplo: PSA Ultrasensível de 3ª geração por quimioluminescência Sensibilidade analítica: 0,003 ng/ml

10 Reação de aglutinação Aglutinação direta: Ex: determinação do grupo sanguíneo ABO e Rh Aglutinação indireta (passiva): Suporte: - Partículas de látex: PCR (proteína C reativa), fator reumatoide - Hemácias revestidas com Ag de Toxoplasma gondii: pesquisa de Ac anti- Toxoplasma gondii

11 Aglutinação direta Ag faz parte naturalmente da célula ou hemácia

12 Aglutinação direta para determinação de Ag de grupos sanguíneos Gel centrifugação

13 Aglutinação indireta ou passiva: 1-Aglutinação de partículas de látex Ex.: pesquisa de proteína C reativa PCR - no soro de um paciente (usa partícula de látex com Ac anti PCR na superfície)

14 Aglutinação indireta ou passiva: II- Reação de aglutinação indireta para pesquisa de anticorpos contra agentes infecciosos Exemplo: pesquisa de Ac contra o Treponema pallidum - Usa hemácias sensibilizadas com Ag de T. pallidum.

15 Reações usando reagentes marcados Conjugado: molécula constituída por duas substâncias ligadas covalentemente e que mantêm as propriedades funcionais de ambas Ex: globulina de carneiro anti IgG humana marcada peroxidase (nesse caso, queremos saber se o Ac primário é IgG) conjugado

16 Técnicas com reagentes marcados

17

18 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) É uma técnica colorimétrica Placa de ELISA (fase sólida)

19 ELISA Pesquisa de anticorpo (ou Ag) no soro do paciente

20 Etapas do ELISA Sensibilização (ou cobertura) dos poços: adição de Ag do agente infeccioso (ou em alguns casos de Ac), seguida de incubação para ligação Bloqueio dos poços: adição de proteína inerte: soro fetal bovino, leite desnatado, seguida de incubação Placa de ELISA Tiras de ELISA lavagens

21 Etapas do ELISA Adição do soro do paciente em diluente, seguida de incubação * Adição do conjugado: anticorpo marcado com enzima (ex: peroxidase), seguida de incubação lavagens

22 Etapas do ELISA Adição do substrato cromogênico: para a peroxidase: H 2 O 2 + OPD ortofenilenodiamina), seguida de incubação não lavar!!!!!!!!!!!! Parar a reação: SDS ou ácido Leitura de absorbância: em leitor de ELISA

23 Leitor de ELISA Leitor de Placa Leitor de Tira

24 Animação de ELISA

25 III - Western Blot Western blot para pesquisa de Ac anti HIV no soro de paciente (técnica confirmatória): 1ª etapa: Fracionamento das proteínas do HIV: separação das proteínas de acordo com peso molecular 2ª etapa: Transferência das proteínas para membrana de nitrocelulose Em seguida, etapas semelhantes ao ELISA Cromógeno usado deve originar produto insolúvel (precipita no local da reação)

26 Western Blot

27 Western Blot

28 Reação de imunofluorescência Conjugado é um anticorpo ligado a substância que emite fluorescência Isotiocianato de fluoresceína (FITC) Ficoeritrina (PE)

29 Imunofluorescência Lâmina de imunofluorescência Microscópio de fluorescência

30 Reação de imunofluorescência direta Pesquisa de antígeno Ex: pesquisa de Chlamydia em secreção vaginal

31 Reação de imunofluorescência direta Pesquisa de antígeno Para pesquisa de Chlamydia: usar Ac anti Clamydia marcado com FITC por exemplo

32

33 Reação de imunofluorescência indireta (RIFI) A- pesquisa de antígeno amostra (Ag??) + Ac comercial Ag-Ac * Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina * microscópio de fluorescência * lavagens

34 Reação de imunofluorescência indireta (RIFI) B- pesquisa de anticorpo contra um agente infeccioso: determinação da classe do Ac e da reatividade do soro do paciente (última diluição com resultado positivo)

35 Quantificação do nível de Ac presente no soro do paciente: diluição sucessiva - A seguir, será testada a reatividade das diferentes diluições do soro ao Ag presente na lâmina de imunofluorescência

36 RIFI para anticorpo anti Toxoplasma gondii

37 Citometria de fluxo citômetro de fluxo ou FACS ( fluorescent-activated cell sorter)

38 Citômetro de luxo

39 Ligação do anticorpo a um marcador de superfície celular Pode-se detectar componentes internos: citocinas, fatores de transcrição, etc

40 Gráficos de citometria de fluxo FSC x SSC FL1 x FL2

41 Aplicações da citometria de fluxo infecção pelo HIV: contagem de linfócitos T CD4 + e CD8 + classificação das imunodeficiências e leucemias diagnóstico da hemoglobinúria paroxística noturna

42 Tutoriais on/tutorials/4intro_flow/player.html erview/player.html

43

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