MÉTODOS SOROLÓGICOS INTERAÇÃO GENO-ANTICORPO. Curso de Ciências Biológicas Disciplina: Imunologia Profa. Dra. Wilma A.

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1 MÉTODOS SOROLÓGICOS INTERAÇÃO ANTÍGENO GENO-ANTICORPO Curso de Ciências Biológicas Disciplina: Imunologia Profa. Dra. Wilma A. Starke Buzetti

2 Termos usados na prática para designar as interações antígeno-anticorpo SOROLOGIA Reação in vitro do antígeno e do anticorpo sorológico (métodos sorológicos) INTERAÇÃO ANTÍGENO GENO- ANTICORPO 1) precipitação (se o antígeno é solúvel), 2) aglutinação (se o antígeno é particulado) e 3) ativação de complemento Antígeno deve ser multivalente e os anticorpos com pelo menos dois pontos de ligação com o antígeno: ligação cruzada entre os anticorpos e os antígenos cross-linking.

3 TESTES LABORATORIAIS IMUNOLÓGICOS SOROLÓGICOS (in vitro) Aglutinação Imunodifusão Imunoeletroforese Fixação de complemento Métodos imunoquímicos e físico-químicos Métodos imunoenzimáticos Radioimunoensaio Técnicas imunoistoquímicas Imunofluorescência Imunoblotting Citometria de Fluxo

4 1) IMUNODIFUSÃO Reação antígeno-anticorpo e precipitação Antígenos solúveis. É realizado em um meio semi-sólido (gel) como o ágar ou agarose. A precipitação ótima e máxima ocorre na zona de equivalência. Precipitação sub ótima ocorre com excesso de anticorpo (prozona) ou com excesso de antígeno.

5 1) IMUNODIFUSÃO Dois tipos: 1) Simples: anticorpo é fixo e o antígeno se move 2) Dupla: antígeno e anticorpo se movem (radial ou linearmente) Aplicação: quantificação de proteínas do soro, anemia infeciosa equina e outras.

6 Imunodifusão Radial Dupla O método Em uma camada de agarose que recobre uma lâmina de vidro são feitos orifícios. Em um orifício é adicionado antígeno e em outro o soro. A lâmina é incubada por 24/48 horas (37ºC). Observa-se a linha de precipitação entre os orifícios.

7 Imunodifusão

8 Placa de Petri com agarose para teste de imunodifusão Imunodifusão Radial Dupla

9 2) IMUNOELETROFORESE A imunoeletroforese combina difusão por separação eletroforética com a precipitação imune de proteínas. Identifica e quantifica proteínas individuais presentes no soro, urina ou outro fluído biológico. Ex: o soro ou urina ou fluído conterão os antígenos a serem analisados pelo anticorpo. Aplicações: diagnóstico de proteinemias

10 2) IMUNOELETROFORESE

11 3) AGLUTINAÇÃO São técnicas semiquantitativas. Antígenos particulados e insolúveis (bactérias ou eritrócitos) ou partículas inertes cobertas com antígenos. A reação é detectada apenas visualmente pela aglutinação (formação de grumos). Bom grau de sensibilidade, maior que o método de sedimentação.

12 3) AGLUTINAÇÃO

13 3) AGLUTINAÇÃO Método Adiciona-se em um tubo o soro teste e o antígeno particulado (bactérias; hemácias ou látex adsorvidos com antígenos). Incuba-se até a formação de aglutinação. Quando ocorrer aglutinação as partículas sedimentam formando um "tapete" no fundo do tubo. A aglutinação das partículas indica a presença de anticorpos específicos para o antígeno.

14 Aglutinação 3) AGLUTINAÇÃO Reação de aglutinação positiva

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16 3.1) HEMAGLUTINAÇÃO

17 Hemaglutinação Teste de Coombs

18 4- TÉCNICAS IMUNOISTOQUÍMICAS 4. 1) Imunofluorescência 4. 2) Enzimáticos

19 1) IMUNOFLUORESCÊNCIA É uma técnica citoquímica ou histoquímica para localização ou detecção de antígenos em tecidos ou células.» 1) Antígeno» 2) Anticorpo marcado (é conjugado com compostos fluorescentes - fluorocomos).» 3) A reação é observada em microscópio de fluorescência. Os antígenos fluorescentes podem ser detectados em virtude da cor brilhante dos anticorpos ligados aos antígenos.

20 IMUNOFLUORESCÊNCIA Aplicação Detecção de células, imunoglobulinas, complemento, microrganismos, cromossomos, células neoplásicas, hormônios, enzimas, parasitas, moléculas, etc.

21 FLUORESCÊNCIA O que é a fluorescência? Comprimento de onda luminosa gerado pela excitação dos fluorocromos, após atingir a absorção máxima da luz ultra violeta. λ = 480 nm O H Fluoresceína O λ = 530 nm CO 2 H Luz ultravioleta incidente de menor comprimento de onda e maior energia Fluorocromo absorção da luz Luz Fluorescente emitida de menor energia e maior comprimento de onda

22 Compostos Fluorescentes fluoresceína (isocianato de fluoresceína FITC: produz cor verde no campo de onda de 517 nm). Rodamina (tetrametil rodamina - produz cor vermelha entre 550 a 580 nm). Fluorocromos

23 IMUNOFLUORESCÊNCIA Proteína: ácido glutâmico descarboxilase (GAG) sobre células beta das ilhotas de Langerhans no pâncreas (cor verde).

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26 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA Exame de Leishmaniose Visceral Canina Preparo das lâminas: promastigotas; Anticorpo Primário: soro do cão a ser testado; Anticorpo Secundário: anti-igg de cão conjugado ao isotiocianato de fluoresceína; Ponto de Corte: 1:40 Técnica utilizada pelo Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ de Belo Horizonte, MG e adaptada por Oliveira et al. (2005).

27 4.2 -Imunoistoquímicos enzimáticos Localização de antígenos nos tecidos. Anticorpos ligados a enzimas. Princípios semelhantes ao da fluorescência, mas com visualização em microscópio de luz branca comum. Enzimas conjugadas aos anticorpos: peroxidase, fosfatase alcalina, e outras.

28 4.2 -Imunoistoquímicos enzimáticos (cont.) Substrato cromogênico da enzima. Após a incubação do tecido com o anticorpo marcado com a enzima, é adicionado o substrato. Na reação da enzima com o substrato produz uma cor que é detectada através do microscópio. Método Direto: Anticorpo primário é marcado com a enzima. Método indireto: Anticorpo secundário (anti-igg contra o anticorpo primário) é marcado com a enzima.

29 Detecção do parasito intacto Substrato New Red (New Red Substrate Kit; Vector Laboratory) Complexo (ABC) Peroxidase (Vectstain ABC Kit; Vector Laboratory) Anticorpo Secundário biotinilado anti - IgG de coelho produzido em cabra Anticorpo Primário IgG de cão anti-leishmania (Soro de cão) Antígeno de Leishmania Segundo Tafuri et al. (2004) adaptado por Starke-Buzetti et al. (2006)

30 Foto de Leishmania no baço de cão

31 Resultados de alguns exames imunoistoquímicos

32 5- MÉTODOS QUANTITATIVOS ENZIMÁTICOS IMUNOENSAIOS ENZIMÁTICOS ( ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY -ELISA) Técnicas quantitativas para detecção de antígenos, haptenos ou anticorpos presentes em soluções, no sangue, fluídos corpóreos e outros.

33 ELISA 1) Quando o anticorpo for quantificado, o antígeno deve ser adsorvido a uma fase sólida (placa de poliestireno ou placas de ELISA). 2) O anticorpo é marcado enzimaticamente (fosfatase alcalina ou peroxidase) e adicionado para encubar com o antígeno (conjugado). 3) Em seguida o substrato cromogênico da enzima é adicionado e na reação positiva ocorre a liberação de cor que é medida em aparelho de colorimetria (leitor de ELISA).

34 ELISA Interpretação A intensidade da cor desenvolvida pelo substrato é proporcional à quantidade de anticorpos (específicos para o antígeno) presentes no soro. A intensidade pode ser analisada por um colorímetro (leitor-elisa), permitindo uma análise quantitativa.

35 Leitor de ELISA

36 ELISA O método pode ser direto ou indireto. Direto: anticorpo primário marcado enzimaticamente. Indireto: Uso conjugado - anti-igg ( anticorpo secundário marcado) contra o anticorpo primário. Outros Métodos Competitivo Sandwiche Aplicações Inúmeras Técnica sensível, estável e segura.

37 ELISA DIRETO Anticorpo primário émarcado 5 LEITOR DE ELISA A B C D E F G H Antígeno Solução bloquedora Anticorpo marcado

38 ELISA INDIRETO Anticorpo secundário émarcado Antígeno LEITOR DE ELISA A B C D E F G H Solução bloquedora Anticorpo sérico Anti-Anticorpo marcado

39 ELISA INDIRETO

40 Execução do teste ELISA indireto

41 ELISA SANDUÍCHE DIRETO Antígeno Solução bloquedora Anticorpo Anti-Anticorp marcado LEITOR DE ELISA A B C D E F G H

42 6- WESTERN-BLOT ( IMMUNOBLOT ) O método Permite identificar um antígeno em uma mistura complexa de proteínas. Etapas do método A primeira etapa envolve uma eletroforese do extrato protéico, separando as proteínas (antígenos) por massa molecular e/ou carga elétrica. A segunda etapa é a transferência das proteínas para uma membrana imobilizante (nitrocelulose). Esta etapa é realizada pela justaposição da membrana com o gel e passagem de corrente elétrica, quando as proteínas são transferidas do gel para a membrana.

43 6- WESTERN-BLOT ( IMMUNOBLOT ) Etapas do Método (cont.) A terceira etapa compreende a reação das bandas antigênicas (proteínas) com o anticorpo primário específico não marcado, o anticorpo secundário marcado enzimaticamente ou radioativamente. A reação é visualizada por cor (enzimática) ou em emulsão fotográfica (radioativa) Interpretação A visualização de uma "banda" permite determinar a presença de anticorpos específicos para um antígeno do extrato protéico.

44 Western Blotting Gel membrana de transferência papel filtro preenchimento tela de suporte Gel/ membrana/ filtro Tampão ( +) ( - ) Separação e detecção de proteínas Identificação de Ac específico Ac radiomarcado ou Ac sec. ligado a enzima

45 6- WESTERN-BLOT ( IMMUNOBLOT ) Equipamentos

46 Western Blotting Eletroforese de proteínas Diferença de tamanho (PM) Mobilidade da proteína Detecção Ag ou Ac

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48 8- CITOMETRIA DE FLUXO Método celular

49 PRINCÍPIOS BÁSICOS DE CITOMETRIA DE FLUXO CITO METRIA FLUXO Célula Medida Movimento Separador de células ativadas por fluorescência (FACS)

50 8- CITOMETRIA DE FLUXO CITÔMETRO DE FLUXO SISTEMA FLUIDO (movimento de partículas em sistema fluido) SISTEMA ÓPTICO (gera e coleta sinais de luz) SISTEMA ELETRÔNICO (converte os sinais ópticos em sinais eletrônicos para o computador)

51 CÂMARA DE FLUXO SISTEMA FLUIDO luz ultravioleta FOCO DO LASER Registra a fluorescência emitida células são contadas e separadas de acordo com a intensidade da fluorescência que reflete a densidade do antígeno

52 8- CITOMETRIA DE FLUXO Método celular Princípio: Identifica antígenos na superfície de células e estas podem ser identificadas e contadas individualmente. Células são identificadas por anticorpos marcados pela fluorescência. As células são colocadas em tubos e em seguida passam por uma corrente de fluxo de radiação laser. Através de computador especial, os sinais e as características das células são captados e registrados (tamanho, granulosidade, fluorescência). Teste quantitativo e qualitativo.

53 Citometria de Fluxo Aplicações: Determinar o tipo e número de células sanguíneas brancas CD4 CD8 CD20 distinguir e isolar populações celulares estudar a distribuição de células ciclo da célula (DNA corado), diferenciação, maturação celular apoptose atividades secretoras (citocinas no interior das células) ) diagnóstico de doenças Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes HIV, Leucemias

54 Citometria de Fluxo Separação de células ativadas por fluorescência Anticorpos contra moléculas de membrana ou Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD) Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente CD 8 CD 4 CD 125 CD 147

55 8- CITOMETRIA DE FLUXO Fluorocromos FL1:isotiocianato de fluoresceína - FITC, emissão de luz visível no comprimento de onda de 530 ± 30 nm, que corresponde à luz verde. FL2:ficoeritrina PE: emissão de luz visível no comprimento de onda de 585 ± 26 nm, o que corresponde à luz laranja. FL3:peridina-clorofila: emissão de luz visível acima de 630 nm, o que corresponde à luz vermelha. Fluorocromo emite luz quando excitado pela luz ultra violeta

56 Citometria de Fluxo Tamanho Granulosidade Fluorescência

57 8- CITOMETRIA DE FLUXO Aparelho Citômetro de Fluxo ou FACS ( fluorescentactivated cell sorter) fonte de excitação: lâmpada de argônio raio laser (488 nm) Características detectadas: tamanho da célula, granulosidade e fluorescência emitida.

58 Gráficos de Citometria de Fluxo - Gráfico de tamanho x granulosidade (FSC x SSC): seleção da população a ser analisada (linfócitos, monócitos, neutrófilos e eosinófilos). Expressão dos resultados - Gráfico de fluorescência (FL1 x FL2): avaliação de características das células.

59 DISPERSÃO BLASTOS POLIMORFONUCLEARES MONÓCITOS LINFÓCITOS DEBRIS/HEMÁCIAS/PLAQUETAS GRANULOSIDADE (SS) VOLUME (FS)

60 Citometria de Fluxo Células Sanguíneas

61 Visão dos dados coletados DOT PLOT: FSC x SSC e FL1 x FL2 Side Scatter CD4 PE CD3 FITC Forward Light Scatter

62 Anticorpos Monoclonais por hoje é só!!!! Obrigada!!!!!!