Bioensaios celulares: Princípios e Aplicações

Transcrição

1 Bioensaios celulares: Princípios e Aplicações Letícia Veras Costa Lotufo Laboratório de Oncologia Experimental Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC lvcosta@secrel.com.br

2 PROGRAMA: 11/02 aula 1 - Princípios básicos Ensaios de citotoxicidade aula 2 Aplicações no estudo de novas drogas anticâncer 12/02 aula 3 Aplicações no estudo de novas drogas anticâncer aula 4 - Morte celular: apoptose versus necrose

3 CITOESQUELETO Microtúbulos (Tubulina) Actina Proteínas motoras Aurora, Pólo quinases Quinesinas

4 MICROTÚBULOS

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7 Segregação cromossômica

8 Aurora papel central na orientação dos cromossomos

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12 Mayer et al., 1999, Science 286, 971.

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15 BIOENSAIOS: Polimerização de tubulina in vitro Ensaios de ligação ( binding ) sítios: taxol, alcalóides da vinca e colchicina Microscopia confocal

16 Polimerização/despolimerização Tubulina Ensaio clássico baseia-se na leitura de absorbância a 340 nm Atualmente pode ser realizado a partir da incorporação de um marcador fluorescentes na tubulina

17 Ensaios de Ligação

18 Ensaios de Ligação

19 Ensaios de Ligação

20 Ensaios de saturação

21 Ensaios de competição Ligação Log [Ligante] M

22 Imunofluorescência para citoesqueleto Microscopia confocal 24h Adição das drogas 24h PBS Fixadas e Permeabilizadas α tubulina 24h Ac Cy5 3h Faloidina FICT RNAse PI Zeiss LSM 510

23 VIAS DE MORTE CELULAR Apoptose vs. Necrose

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26 APOPTOSE Definição Descrita em 1972 e denominada seguindo o termo grego cair fora. Termo morte programada da célula ( PCD ) Apoptose Apoptose-like PCD Necrose-like PCD

27 APOPTOSE Definição É uma forma de morte celular destinada a eliminar células indesejáveis, do hospedeiro, através da ativação de uma série coordenada e programada de eventos executados por um conjunto exclusivo de produtos gênicos. ( Robbins, 2000).

28 APOPTOSE 1. Durante o desenvolvimento 2. Mecanismo homeostático para manter as populações celulares nos tecidos 3. Mecanismo de defesa, como nas reações imunes 4. Quando as células são lesadas por uma doença ( corpúsculos de Councilman) ou agentes nocivos ( calor, radiação, hipóxica, drogas anti-câncer citotóxicas) 5. Envelhecimento

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30 MECANISMOS MOLECULARES Via Intrínseca:

31 MECANISMOS MOLECULARES Via extrínsica Ativação de pro-caspases pelo TNF-α e Fas ligante. Receptores da superfície celular associa-se com uma proteína adaptadora com domímio de morte. Apoptose mediada por Fas-Fas ligante ( eliminação de linfócitos ativados de uma reação imune)

32 MECANISMOS MOLECULARES Via extrínsica Apoptose induzida por TNF TNF R1 TRADD FADD Ativação do fator de transcrição nuclear κb ao estimular a degradação do seu inibidor ( I κb)

33 MECANISMOS MOLECULARES Apoptose estimulada por linfócitos T citotóxicos LTC estimula a secreção de perfurina Serina protease granzima B cliva proteínas com resíduos de aspartato e ativa caspases. Apoptose após privação de fator de crescimento Bcl 2 movem se para o citosol Aumento da permeabilidade da membrana Apoptose mediada por lesão de DNA DNA lesado acúmulo de p53 interrompe o ciclo celular na fase G1. Falha do reparo apoptose.

34 Vias não-apoptóticas de morte Necrose celular Morte celular autofágica Morte celular independente de caspase Ativação de caspases Clivagem da bomba de cálcio Fragmentação de DNA por caspases

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36 Análise morfológica Coloração Diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de Acridina Montar placa Incubar com droga BE LA Contagem 24h Célula viável Célula apoptótica Célula necrótica Núcleo MCGAHON et al., 1995

37 Citometria de fluxo Fluxo Amostra de Detectores Amostra Foward Angle Light Scatter Forward Angle Light Scatter Tampão Laser Sistema de Luzes Lixo Sistema Fluídico Filtros Ópticos Side Angle Side Light Scatter Angle Scatter Green Flourescen fluorescence ce (FL1 ) Red-Orange - Red Flourescen e fluorescence ce (FL2 ) Red Flourescen fluorescence ce (FL3 ) Sistema Óptico e Eletrônico Fluorescência Sistemas de Controle e Arquivo de Dados Forward Angle Light Scatter

38 Visão dos Dados HISTOGRAMA: Intensidade de fluorescência x número de células FITC FITC FITC FITC FITC Number of Events FITC FITC FITC Intensidade de Fluorescência FITC FITC Counts Positive cells FL-2

39 INTEGRIDADE DA MEMBRANA CELULAR CITOMETRIA DE FLUXO Montar placa Incubar PBS PI com droga centrifuga 24h

40 Fragmentação do DNA Citometria de fluxo Montar placa Incubar com droga centrifuga PI + tampão de lise 24h 30 mim

41 DNA Ladder

42 Potencial transmembrânico da mitocôndria - Citometria de fluxo Montar placa Incubar com droga centrifugar Rodamina centrifugar 24h 15 mim PBS

43 Identificação de fosfotidilserina externalizada - Anexina V

44 Ativação de CASPASES Citometria de fluxo Western Blot (Eletroforese) Kits colorimétricos Kits fluorimátricos