PROPOSTA DE TUTORIA DE PROJECTOS
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1 PROPOSTA DE TUTORIA DE PROJECTOS Disciplinas de Investigação do Mestrado Integrado em Medicina Orientador responsável (docente ou investigador doutorado da FMUC): Paulo de Carvalho Pereira Rosa Fernandes Centro/Serviço/Instituto: Centro de Oftalmologia IBILI, FMUC Área Temática do Projecto: Biologia Celular e Molecular/ Fisiologia Duração do projecto: 2 semestres. Pode ser continuado no tempo. (indicar especificamente se o projecto é susceptível de ser continuado ao longo do tempo do curso) Financiamento: Sim Não sim Agência Financiadora:FCT Exigência de competências prévias aos alunos? Sim Não Quais? Conhecimentos gerais de Biologia Celular/Molecular e Bioquímica (não aplicável a alunos do 1º e 2º anos do mestrado integrado) Título do projecto: Disfunção endotelial na retinopatia diabética Resumo (Max. de 300 palavras): A Diabetes Mellitus é um síndroma complexo, muitas vezes associada à retinopatia diabética (RD) e perda de visão. O aumento da permeabilidade dos vasos da retina é uma característica da retinopatia diabética. Os mecanismos celulares e moleculares que estão na origem das lesões 1
2 vasculares na retinopatia diabética são complexos e ainda mal compreendidos. É, no entanto, geralmente aceite que a produção excessiva do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) tem uma função crítica na proliferação das células endoteliais, levando a um aumento da permeabilidade vascular e eventualmente à ruptura da barreira hemato-retiniana. O VEGF é produzido principalmente na fase da retinopatia não proliferativa, pelas células não vasculares da retina, incluindo células ganglionares, células de Muller e astrócitos e RPE. Isto sugere que o aumento da permeabilidade vascular deve ser uma consequência da acção dos compostos vasoactivos da retina neuronal actuando secundariamente na microvascularização. O VEGF pode ser produzido em resposta a uma variedade de estímulos, sendo um dos mais bem conhecidos o que envolve a activação da factor induzido por hipóxia (HIF). Foi recentemente demonstrado que a neovascularização depende, principalmente, de factores angiogénicos como o VEGF, mas que a manutenção da integridade de vasos recém formados depende de outros mecanismos de regulação. O HIF é um heterodímero composto por uma subunidade HIF-1b expressa constitutivamente e por uma subunidade HIF-1a indutível. Sob condições de normóxia, o HIF-1 sofre uma hidroxilação das prolinas dependente de oxigénio, a qual é necessária para a ligação da proteína supressora tumoral VHL, o componente de reconhecimento de uma ligase de ubiquitina, a qual direcciona o HIF-1 α para a degradação pelo proteassoma. Em condições de hipóxia, o oxigénio, torna-se limitante para a actividade de hidroxilase das prolinas e a ubiquitinação do HIF-1α é inibida. Como resultado, o HIF-1α acumula-se, forma um dímero com Hif-1ß, e activa a transcrição de genes alvo, como o VEGF. Este projecto propõe um modelo que associa a acumulação do HIF-1 em células neuronais da retina ao aumento da produção do VEGF, o qual actua ao nível das células endoteliais (modelo de co-cultura) estimulando a angiogénese característica da RD. A abordagem proposta neste projecto pode contribuir para esclarecer um novo mecanismo que associa a hiperglicémia a um aumento da proliferação das células endoteliais permitindo novas abordagens terapêuticas para a RD. 2
3 (área, importância, meios, metodologias, etc.) Objectivos (Max de 500 palavras): Neste projecto propõe-se que a perda de viabilidade celular em resposta à isquémia, resulta da degradação excessiva do HIF-1α por compostos secundários ao metabolosimo da glicose, levando à diminuição de transcrição de genes alvo do HIF-1 α e a uma resposta deficiente à isquémia na diabetes. Este projecto tem como objectivo numa 1ª fase caracterizar as fases iniciais da disfunção vascular (retina, aorta, coração e rim) induzidas pela diabetes num modelo animal de diabetes. Numa fase posterior, pretende-se avaliar as consequências fisiológicas da destabilização do HIF- 1a na diabetes, nomeadamente na alteração de produção de VEGF e outros genes induzidos pelo HIF-1. 3
4 Plano de trabalhos (Max de 1500 Palavras): Numa primeira fase e de forma a caracterizar as alterações iniciais associadas à progressão da diabetes, nos ratos GK, serão avaliados vários parâmetros, incluindo níveis de glicose e lípidos no plasma, teste de tolerância à glicose, hemoglobina glicosilada, biomarcadores de stress oxidativo, marcadores de lesão renal e pressão sanguínea. Os resultados destes testes serão analisados em função da idade dos animais e da progressão da doença. Com o objectivo de caracterizar a disfunção cardíaca, serão avaliadas a LDH e fosfocinase da creatina no plasma dos ratos dioabéticos GK. As anomalias nos electroretinogramas entre os animais diabéticos caracterizam-se por reduzidas amplitudes na onda beta e potenciais oscilatórios reduzidos ou ausentes (OPs). De facto, antes do início da retinopatia e aparecimento de lesões visíveis na retina, observa-se uma redução dos OPs. Logo, OP é considerado um indicador sensível da RD. Assim, serão efectuados ERG e angiografia com fluoresceína, com o objectivo de caracterizar as fases iniciais da RD nos ratos GK. O efeito da diabetes na distribuição subcelular de VEGF, Ang-1, Ang-2 e HIF-1a nas células da retina e coração, vaso e rim, será avaliado por técnicas de imunofluorescência. As alterações histológicas na retina do rato GK serão analisadas com o objectivo de elucidar a extensão e progressão da retinopatia. As alterações subtis como espessamento da membrana basal das retinas de animais diabéticos podem ser identificadas por microscopia electrónica. Assim, a redistribuição de HIF-1a na retina, rim, coração e microvasos será avaliada por imunofluorescência ou por microscopia electrónica. O efeito da diabetes nas alterações dos níveis do factor de transcrição, HIF-1a e secreção do factor angiogénico VEGF será avaliado por análise de western blot ou ELISA. Após caracterização das alterações iniciais que ocorrem no modelo animal de diabetes, numa fase seguinte serão avaliadas as consequências fisiológicas da destabilização do HIF-1a na diabetes. Serão avaliados os níveis e distribuição de vários marcadores como o HIF-1a, Ang-1, Ang-2, VEGF, e proteinas modificadas pelo metilglioxal. A distribuição subcelular será avaliada por microscopia confocal de imunofluorescência e, quando apropriado, por microscopia electrónica de transmissão. As proteínas de extractos de retina, coração e rim de animais não diabéticos e diabéticos serão separadas por SDS-PAGE e analisadas por western blotting. A activação do HIF-1 será avaliada por ensaios de alteração da mobilidade electroforética em gel. De modo a investigar de que forma a hiperglicémia e a diabetes modificam a resposta celular e do tecido à hipóxia, os animais serão mantidos numa câmara de hipóxia normobárica. Em seguida, os ratos serão colocados em condições de normóxia. Os níveis dos aductos proteicos de metilglioxal, 4
5 do factor de transcrição HIF-1a, e o factor angiogénico VEGF serão avaliados por western blotting. O efeito da hipóxia na distribuição subcelular de VEGF, Ang-1, Ang-2 e HIF-1a nas células da retina e coração, aorta, cérebro e rim será valiado por microscopia confocal de imunofluorescência. A apoptose das células da retina, coração, aorta e rim será detectada com o ensaio de TUNEL. (fases, objectivos, metodologias, resultados de cada fase, calendarização, etc.) 5
6 Competências específicas do projecto a adquirir pelo aluno: (Entre outros requisitos, os alunos deverão ser capazes de formular uma hipótese científica; ser capazes de desenhar um projecto científico e identificar a sua relevância face ao estado do actual do conhecimento; saber desenhar experiências científicas aplicando protocolos específicos; saber interpretar e discutir de forma crítica os resultados obtidos; descrever e expor oralmente os resultados obtidos.) 6
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