Projecto Tutorial. Molecular Mechanisms of McArdle s Disease (Muscle Glycogen Phosphorylase Deficiency) RNA and DNA Analysis
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- Joaquim Canário Santarém
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1 Projecto Tutorial Molecular Mechanisms of McArdle s Disease (Muscle Glycogen Phosphorylase Deficiency) RNA and DNA Analysis Gautron, S., Daegelen, D., Mennecier, F., Duboq, D., Kahn, A., and Dreyfus J. (1987). J. Clin.Invest. 79: Duarte Nuno Amorim dos Santos Instituto Superior de Ciências da Saúde - Norte
2 Glicogénio Polissacarídeo ramificado constituído por subunidades de glucose unidas por ligações α-1,4 e α-1,6. É um meio de armazenamento de energia rapidamente mobilizável nas células animais. É encontrado, principalmente, no fígado e músculo e, secundariamente, nos rins e intestinos. A sua estrutura ramificada permite a libertação rápida da glicose. A sua síntese e regulação são sujeitas a controlo hormonal.
3 Metabolismo do Glicogénio Síntese vs Degradação Síntese A glucose 6-fosfato convertese a glucose 1-fosfato pela fosfoglucomutase A síntese de glicogénio a partir de UDP-glicose é executada pela glicogénio sintase. Degradação A glicogénio fosforilase remove resíduos de glicose- 1-fosfato A glicose 1-fosfato é convertida em glicose 6- fosfato pela acção da enzima fosfoglicomutase. A glicosil (4-6)-transferase cria uma ramificação nos resíduos de glicose α-1, 6. A glicose 6-fosfatase catalisa a hidrólise da glicose 6-fosfato a glicose (fígado).
4 Regulação do Glicogénio A regulação do metabolismo do glicogénio é afectada específicas, nomeadamente:insulina, epinefrina e glucagon. por hormonas Enzimas alvo: GLICOGÉNIO FOSFORILASE e GLICOGÉNIO SINTETASE A insulina assinala um estado alimentado e induz a síntese de glicogénio no fígado Activa a glicogénio sintetase. A epinefrina e o glucagon promovem a glicogenólise. A epinefrina actua primariamente no músculo esquelético. O glucagon actua primariamente no fígado. Ambas promovem a síntese de AMPc e a activação da glicogénio fosforilase.
5 Doenças do metabolismo de Glicogénio As glicogenoses são doenças provocadas por um erro inato do metabolismo do glicogénio. O erro dá-se pela ausência ou deficiência enzimática na síntese ou degradação do glicogénio, resultando numa alteração na concentração e/ou na estrutura do glicogénio em diversos tecidos do organismo. TIPO DENOMINAÇÃO ENZIMA TECIDOS I D. de von Gierke Glicose-6-fosfatase Fígado, músculos e intestino II D. de Pompe α -1,4-glicosidade Coração, músculos e intestino III D. de Cori Amilo-1,6-glicosidase Fígado, músculos e coração IV D. de Andersen Amilo-(1,4-1,6)-transglicosidase Fígado V D. McArdle Glicogénio fosforilase muscular Músculo VI D.Hers Glicogénio fosforilase hepática Fígado VII Taruí Fosfofrutocinase muscular Músculos VIII Fosforilase cinase Fígado e cérebro Tabela 1: Tipos de doenças geradas por um erro no metabolismo do glicogénio e sua classificação de acordo com o defeito enzimático específico e órgãos afectados.
6 Doença de McArdle: Sintomatologia É uma forma rara de uma patologia metabólica. É caracterizada pela deficiência na actividade da glicogénio fosforilase muscular. É transmitida geneticamente como um traço autossómico recessivo. Os sintomas são vários, entre os quais: Cãimbras ao fazer exercício; Fadiga fácil; mionecrose e mioglobinúria na tentativa de exercício físico intenso e níveis baixos de lactato após exercício.
7 Glicogénio fosforilase Existe sob a forma de três isoenzimas: A Glicogénio fosforilase-bb, presente no cérebro, mas também encontrada no miocárdio. A Glicogénio fosforilase LL que é a isoenzima predominante no fígado. A Glicogénio fosforilase MM que se encontra no músculo estriado. A forma muscular é a única isoenzima expressa no músculo esquelético, mas encontra-se também presente no coração e cérebro.
8 Objectivo do trabalho Estudar a nível molecular a glicogénio fosforilase muscular. Verificar as alterações ao nível da expressão da glicogénio fosforilase e da actividade da enzima, ocorridas em pacientes com a doença de McArdle
9 Procedimento Geral I- Identificação por hibridação heteróloga do cdna da glicogénio fosforilase muscular humana e sua sequenciação de cdna Construção de uma biblioteca Clonagem Rastreio de uma biblioteca de cdna Placa de lise Sonda de ácido nucleico marcada com 32p Sonda hibrida com DNA ligado aos fagos que contêm a sequência complementar DNA clonado Transferência para Placa de lise nitrocelulose Placa mestra Membrana réplica Hibridação da sonda com DNA ligado ao filtro Lavagem das sondas não incorporadas
10 Procedimento Geral II- Determinação, por Northern-blot, dos níveis de RNAm da glicogénio fosforilase-mm em diferentes tecidos humanos III- Análise da expressão e da actividade da glicogénio fosforilase em diferentes pacientes McArdle Análise dos níveis de RNAm da glicogénio fosforilase por Northern-blot Análise dos níveis de proteína por SDS-PAGE Determinação da actividade enzimática. IV- Análise do DNA genómico de pacientes McArdle por Southern-blot
11 Resultados I- Identificação do cdna da Glicogénio Fosforilase Muscular Humana Screening de uma biblioteca de cdna humana, utilizando como sonda cdna de glicogénio fosforilase muscular de coelho. Hibridação heteróloga Mapeamento por restrição enzimática dos clones positivos. Identificação de três clones que se sobrepõe ao cdna da glicogénio fosforilase muscular de rato e humano.
12 Sequenciação do cdna isolado Região codificante + região 3 94% de homologia entre a sequência proteica deduzida e a glicogénio fosforilase muscular do coelho. 90% homologia entre as sequências nucleotídicas. Confirmação da identidade da glicogénio fosforilase por sequenciação do cdna
13 Determinação dos níveis de RNAm da glicogénio fosforilase muscular em diferentes tecidos humanos Isolamento de RNAm de diferentes tecidos (músculo, fígado, cérebro e pulmão) Northern Blot: sonda - Clone 18 F11 Músculo do adulto Fígado Cérebro adulto fetal Pulmão Músculo Músculo do adulto fetal Transcrito de 3,4 kb Proteína com aproximadamente 840 aminoácidos Cerca de pb de região não codificante Glicogénio fosforilase muscular é expressa no músculo de adulto e fetal, mas não no cérebro, pulmão e fígado.
14 Análise da glicogénio fosforilase em pacientes McArdle Ausência de actividade da glicogénio fosforilase muscular Ausência da banda correspondente à glicogénio fosforilase em SDS-PAGE Análises feitas a biópsias musculares de 10 doentes McArdle mostraram ausência de proteína e de actividade enzimática da glicogénio fosforilase.
15 Análise por Northern-blot dos níveis de RNAm da glicogénio fosforilase do tecido muscular de diferentes pacientes Controlo C 1 C 0,5 C b C b C 1 C 0,5 C C b C b 8 H H 2 C- Controlo; 1 a 10- doentes McArdle; H1 e H2- Heterozigóticos Exibição de Heterogeneidade molecular ao nível do RNAm
16 Análise do DNA genómico por Southern-blot A Sonda 600 B Sonda 600 e 700 Os padrões de restrição obtidos nos diferentes pacientes foram idênticas aos do controlo. Sonda 600 e 700 Sonda 600 e 700 As mutações ao nível do DNA deverão corresponder a mutações pontuais ou pequenas delecções.
17 Conclusões Foram identificados 3 clones de cdna de glicogénio fosforilase muscular humano por hibridação heteróloga com cdna de glicogénio fosforilase muscular de coelho. A sequenciação do cdna isolado revelou 94% de homologia entre a sequência proteica deduzida e a glicogénio fosforilase muscular do coelho A análise da expressão da glicogénio fosforilase MM por Northern-Blot levou à identificação de um RNAm de 3,4 kb presente no músculo de adulto e fetal, mas ausente no fígado e cérebro.
18 Conclusões (continuação) Análise da expressão e actividade da glicogénio fosforilase muscular em doentes McArdle Ausência de actividade enzimática e da banda da glicogénio fosforilase em gel de SDS-PAGE RNAm ausente em tecido muscular de alguns pacientes e presente em menor quantidade no de outro. heterogeneidade molecular ao nível do RNAm Presença de RNAm não funcional em menor quantidade Ausência de RNAm A análise por Southern Blot confirmou que a doença se deve a uma mutação pontual ou a uma pequena delecção no gene que codifica a enzima glicogénio fosforilase muscular
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