Instituto Superior Ciências da Saúde- Norte. Diana Duarte de Sousa. Ano lectivo 2006/2007. Licenciatura em Bioquímica, 2º Ano

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1 Projecto Tutorial Análise de um artigo científico relacionado com YFP Instituto Superior Ciências da Saúde- Norte Ano lectivo 2006/2007 Diana Duarte de Sousa Licenciatura em Bioquímica, 2º Ano

2 Expressão da Catalase em células alfa de ratos diabéticos e não diabéticos Bloch K, Shicham E, Vorobeychik M,Bloch D, Vardi P (2007).Catalase expression in pancreatic alpha cells of diabetic and non-diabetic mice. Histochemistry and cell Biology 127(2):

3 Introdução Catalase Catalase = Hidroperoxidase; Localiza-se no peroxissoma e citoplasma; Quatro cadeias polipéptidicas de 60 kda; Cada cadeia possui um grupo heme e este um ião ferro; Classe das oxidorredutases; Catalisa uma reacção de dismutação: 2 H2O2 2H2O + O2; K cat = 4 x 10-7 uma molécula de catalase pode catalisar a decomposição de moléculas de H2O2 por segundo!!!

4 Introdução Pâncreas < Órgão exócrino (secreta suco pancreático) e endócrino (produz hormonas); < É constituido por ilhéus de Langerhans; < Células endócrinas dos ilhéus pancreáticos: β (insulina), α (glucagon), (somatostatina), PP (produtoras de polipéptidos). células β no núcleo do ilhéu; < Roedor: camada de células α, e PP. < Humano: células α dispersas pelo ilhéu.

5 Introdução Estudos anteriores: < Células β têm pouca expressão e actividade da catalase alta sensibilidade ao H2O2. Transfecção (catalase) de células β protecção contra Streptozotocin e espécies com oxigénio reactivo. < Exposição de células de insulinoma a H 2 O 2 célulasβcom maior expressão da catalase desenvolveram melhor defesa contra stress oxidativo. < Função célulasα:regulação metabólica (homeostasia de glicose em jejum). < Células α mais resistentes a toxinas diabetogénicas e ataque auto-imune do queβ. < Mecanismos de defesa de células pouco conhecidos.

6 Objectivos Objectivo: Avaliar possível envolvimento da catalase na protecção das células alfa análise da expressão e localização da proteína em ratos diabéticos e não diabéticos

7 Abordagem experimental Ratos não diabéticos: I)Histoquímica Remoção e fixação do pâncreas II) Colorações III) Visualização Coloração HE (controlo) Cortes de 5µm Imuno fluorescência Microscópio de luz Microscópio confocal Técnica indirecta imunoperoxidase Anticorpos policlonais: Anti-catalase Anti-insulina Anti-glucagon IV) Estimativa da área de células α Image- Pro Plus

8 Abordagem experimental Ratos diabéticos: I) Indução de diabetes Streptozotocin II)Histoquímica Remoção e fixação do pâncreas (após 3 semanas de hiperglicemia) III) Colorações IV) Visualização Coloração HE (controlo) Cortes de 5µm Imuno fluorescência Microscópio de luz Microscópio confocal Técnica indirecta imunoperoxidase Anticorpos policlonais: Anti-catalase Anti-insulina Anti-glucagon V) Estimativa da área de células α Image- Pro Plus

9 Diabetes Diabetes tipo I - Infância ou adolescência - Destruição das células beta pancreáticas por processos auto-imunes corpo produz pouca ou nenhuma insulina Diabetes tipo II - Adultos - Células beta produzem muita insulina diminuição na resposta dos receptores de glicose presentes no tecido periférico resistência à insulina

10 Ratos normais: Ratos diabéticos: Catalase (H.E.) Catalase (H.E.) Insulina (IP) Insulina (IP) - Morfologia dos ilhéus bem preservada; - Células α na periferia do ilhéu; - Insulina na maioria das células; - Glucagon e catalase nas células periféricas. -Ilhéus atrofiados e degenerados no centro; - Células α em quase todo o ilhéu; -Vestígios de insulina nas células; - Glucagon e catalase muito concentrados nas células centrais e periféricas.

11 Ratos normais: Ratos diabéticos: Glucagon (IP) Glucagon (IP) Catalase (IP) Catalase (IP) - Morfologia dos ilhéus bem preservada; - Células α na periferia do ilhéu; -Insulina na maioria das células; - Glucagon e catalase nas células periféricas. -Ilhéus atrofiados e degenerados no centro; - Células α em quase todo o ilhéu; -Vestígios de insulina nas células; - Glucagon e catalase muito concentrados nas células centrais e periféricas.

12 Ratos normais: Ratos diabéticos: Catalase Catalase Glucagon Glucagon - Catalase e glucagon presentes mesmo tipo celular; - Catalase nas células α. - Catalase e glucagon distribuídos no citoplasma; - Co-expressão intra-ciotplasmática parcial da catalase e glucagon. - Catalase e glucagon presentes no mesmo tipo celular; - Catalase e glucagon nas células α. - Catalase e glucagon distribuídos pelo citoplasma; - Co-expressão intra-citoplasmática parcial da catalase e glucagon.

13 Ratos normais: Ratos diabéticos: Catalase + Glucagon Catalase + Glucagon - Catalase e glucagon presentes mesmo tipo celular; - Catalase nas células α. - Catalase e glucagon distribuídos no citoplasma; - Co-expressão intra-ciotplasmática parcial da catalase e glucagon. - Catalase e glucagon presentes no mesmo tipo celular; - Catalase e glucagon nas células α. - Catalase e glucagon distribuídos pelo citoplasma; - Co-expressão intra-citoplasmática parcial da catalase e glucagon.

14 Ratos normais: Ratos diabéticos: Catalase Catalase Glucagon Glucagon - Catalase e glucagon presentes mesmo tipo celular; - Catalase nas células α. - Catalase e glucagon distribuídos no citoplasma; - Co-expressão intra-ciotplasmática parcial da catalase e glucagon. - Catalase e glucagon presentes no mesmo tipo celular; - Catalase e glucagon nas células α. - Catalase e glucagon distribuídos pelo citoplasma; - Co-expressão intra-citoplasmática parcial da catalase e glucagon.

15 Ratos normais: Ratos diabéticos: Catalase + Glucagon Catalase + Glucagon - Catalase e glucagon presentes mesmo tipo celular; - Catalase nas células α. - Catalase e glucagon distribuídos no citoplasma; - Co-expressão intra-ciotplasmática parcial da catalase e glucagon. - Catalase e glucagon presentes no mesmo tipo celular; - Catalase e glucagon nas células α. - Catalase e glucagon distribuídos pelo citoplasma; - Co-expressão intra-citoplasmática parcial da catalase e glucagon.

16 Efeito dos diabetes nas células α: Área dos ilhéus mais pequena em ratos diabéticos Ausência de insulina na parte central do ilhéu Contudo Área ocupada pelas células α é maior em animais diabéticos!!

17 Células α mais resistentes à diabetes do que β α têm níveis mais elevados de catalase (inactiva H 2 O 2 ) Diabetes induzidos por Streptozotocin Utiliza GLUT 2 para transportar glucose para as células alvo Resistência de células α dependente da expressão de GLUT 2

18 Ligação entre a glicose sanguínea e a secreção de insulina: Mecanismo sensorial da glucose (GLUT2 e Glucocinase); canais K + (potencial da membrana); Ca 2+ (voltagem da membrana). GLUT2 e Glucocinase: baixa afinidade para glucose!

19 Ligação entre a glicose sanguínea e a secreção de insulina: Mecanismo sensorial da glucose (GLUT2 e Glucocinase); canais K + (potencial da membrana); Ca 2+ (voltagem da membrana). GLUT2 e Glucocinase: baixa afinidade para glucose!

20 Células α mais resistentes à diabetes do que β α têm níveis mais elevados de catalase (inactiva H 2 O 2 ) Diabetes induzidos por Streptozotocin Utiliza GLUT 2 para transportar glucose para as células alvo Resistência de células α dependente da expressão de GLUT 2

21 Expressão da enzima anti-oxidante (catalase) Envolvido na defesa celular Ratos com sobreexpressão de catalase nas células Libertação controlada de catalase Maior protecção a STZ Maior viabilidade e função das células dos ilhéus (in vitro)