PROPOSTA DE TUTORIA DE PROJECTOS
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- Zaira Teixeira
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1 PROPOSTA DE TUTORIA DE PROJECTOS Disciplinas de Investigação do Mestrado Integrado em Medicina Orientador responsável (docente ou investigador doutorado da FMUC): Cristina Maria Tristão Sena e Raquel Maria Fino Seiça Centro/Serviço/Instituto: Instituto de Fisiologia csena@ci.uc.pt Área Temática do Projecto: Aterosclerose e diabetes tipo 2 Duração do projecto: 2 anos (indicar especificamente se o projecto é susceptível de ser continuado ao longo do tempo do curso) Financiamento: Sim Sim Agência Financiadora: GAI Exigência de competências prévias aos alunos? Sim Quais? (não aplicável a alunos do 1º e 2º anos do mestrado integrado) Título do projecto: AGEs e complicações vasculares na diabetes tipo 2 Resumo (Max. de 300 palavras): A diabetes mellitus está a aumentar em todo mundo, resultando da interacção entre a obesidade, a inflamação e a hiperglicemia. As complicações macro e microvasculares da diabetes mellitus são a principal causa de mortalidade associada a esta patologia. A perda do papel modulador do endotélio é considerado um factor crítico na patogénese de doenças vasculares associadas à diabetes. Diversos factores parecem estar envolvidos no decremento da função do endotélio vascular nomeadamente a 1
2 hiperglicemia, a dislipidemia, a formação de produtos de glicação avançada (AGEs) e o stress oxidativo, no entanto, os mecanismos subjacentes permanecem por esclarecer. Por isso, vamos dedicar a nossa atenção ao estudo da disfunção endotelial vascular em ratos Goto- Kakizaki (ratos GK) e à importância dos mecanismos que envolvem a produção de AGEs e HIF-1 α (hypoxia-inducible factor 1α) na diabetes tipo 2. Demonstrámos nos ratos GK, um modelo animal de diabetes tipo 2, uma disfunção endotelial associada a aumento dos níveis de stress oxidativo e a uma diminuição de algumas defesas anti-oxidantes nomeadamente os níveis de coenzima Q e de glutationa GSH. Sabemos por outro lado que, a administração de metilglioxal conduz a aumentos dos níveis de AGEs e consequentemente agravamentos das complicações associadas à diabetes tipo 2. Por este facto, propomo-nos estudar os efeitos do metilglioxal em diversos parâmetros metabólicos, de stress oxidativo e função endotelial em ratos GK. Serão ainda caracterizadas proteínas ao nível da parede arterial envolvidas nos processos ateroscleróticos associados à diabetes tipo 2 e os potenciais benefícios terapêuticos da metformina e da piridoxamina na função endotelial e prevenção da aterosclerose associada à síndrome diabética. (área, importância, meios, metodologias, etc.) Objectivos (Max de 500 palavras): Neste trabalho, pretendemos estudar os ratos GK, que são um modelo animal espontâneo de diabetes tipo 2 não obesa; quando sujeitos a aumentos pronunciados dos níveis de AGEs por indução com metilglioxal. Serão ainda avaliados os benefícios terapêuticos de suplementos de piridoxamina (um derivado da vitamina B6 e inibidor da formação de AGEs) e de metformina (uma biguanida utilizada como anti-diabético oral, com novas funções anti-oxidantes e antiinflamatórias) no endotélio vascular e em diferentes marcadores de stress oxidativo e de inflamação neste novo modelo de aterosclerose diabética. Plano de trabalhos (Max de 1500 Palavras): 1. INTRODUÇÃO A diabetes mellitus é uma doença crónica caracterizada por um estado de aterosclerose acelerada e de etiologia multifactorial, pelo que o seu tratamento não pode ser encarado apenas na perspectiva da normalização da glicemia. A disfunção endotelial é considerada um factor crítico e um marcador precoce da doença vascular que surge precocemente na diabetes mellitus. O endotélio é um orgão envolvido no controlo do tónus vascular, na manutenção da fluidez do sangue, na regulação do equilíbrio coagulação e 2
3 fibrinólise, na permeabilidade vascular e na inflamação e adesão de leucócitos (1). Foram já relacionados com as lesões endoteliais induzidas por hiperglicemia cinco mecanismos moleculares importantes: activação de isoformas da proteína cinase C, aumento do fluxo da via das hexosaminas, aumento da formação dos produtos finais de glicação avançada (AGEs), aumento do fluxo da via do poliol e activação do factor de transcrição nuclear pró-inflamatório factor nuclear κb (2,3). Todos estes mecanismos estão independentemente associados ao excesso de produção de superóxido pela cadeia de transporte de electrões nas mitocôndrias (4). Em resultado disso, a formação induzida pela hiperglicemia de espécies reactivas de oxigénio (ROS) pode causar disfunção endotelial, diminuindo a biodisponibilidade de óxido nítrico e prostaciclina e aumentando a síntese dos vasoconstritores prostanóides e endotelina e promovendo a formação de placas ateroscleróticas (5). Esta hipótese atraente necessita de ser testada de maneira mais aprofundada para elucidar completamente o papel das ROS na patogénese da aterosclerose diabética. Por outro lado, torna-se cada vez mais evidente que a hipóxia desempenha um papel fundamental em todas as complicações da diabetes. A hiperglicemia induz uma situação de pseudo-hipóxia. Esta teoria baseia na evidência de que aumentos na concentrações de glicose induzem um aumento da razão NADH + /NAD + nas células mesmo quando a tensão de oxigénio é normal. As respostas a esta situação são mediadas pelo factor induzido pela hipóxia (HIF-1), que é um factor de transcripção heterodimérico. A estabilização do HIF- 1 α conduz a supra activação de uma série de genes envolvidos na angiogénese, metabolismo energético glicolítico e proliferação celular (6). Demonstrámos recentemente nos ratos GK uma diminuição da função endotelial, associada a aumentos de stress oxidativo, agravada pela idade e/ou após administração de dieta aterogénica. 2. PROGRAMA DE TRABALHO 2.1. Animais e sua manutenção: Os animais diabéticos (ratos GK) e os animais controlo não diabéticos (ratos Wistar/W) serão obtidos das nossas colónias. Serão estudados 10 machos Wistar e 40 machos GK com 6 meses de idade. Os ratos GK serão divididos em 4 grupos: 1) grupos GK e W controlo; 2) grupo GK tratado com metilglioxal; 3) grupo GK com metilglioxal e metformina; 4) grupo GK tratado com metilglioxal e piridoxamina. 2.2 Determinação de parâmetros metabólicos e marcadores de stress oxidativo Serão efectuadas, antes e no final do tratamento, provas de tolerância à glicose por via intra-peritoneal (após jejum; método da glicose-oxidase). Antes e após o tratamento serão determinadas as concentrações dos lípidos, da hemoglobina A 1C, da creatinina, da albumina, da proteína C reactiva, da IL-6, do TNF-α, do fibrinogénio e da bilirrubina. No final do tratamento serão avaliadas as concentrações do MDA (biomarcador de peroxidação lipídica), da glutationa GSH, dos compostos 3
4 carbonilo e dos níveis de 8-hidroxi-2 -deoxiguanosina OHdG (um índice de agressão oxidativa do DNA), de albumina e de creatinina na urina de acordo com métodos anteriormente descritos (7). Os níveis de nitritos e nitratos na urina e na parede das artérias serão determinados pelo método de Griess Estudos funcionais de vasodilatação dependente do endotélio Vamos proceder a um estudo comparativo do relaxamento de artérias dependente e independente do endotélio nos diferentes grupos de animais GK de acordo com o anteriormente descrito (8). Vamos estudar o papel dos AGEs neste processo e os potenciais benefícios terapêuticos da piridoxamina e da metformina na função endotelial das artérias: aorta e renal. 2.4 Determinação dos níveis de anião superóxido e de expressão de enos e nitrotirosina na parede vascular A utilização de uma sonda fluorescente para visualizar os níveis de anião superóxido na parede vascular será de acordo com o método de Miller e colaboradores (9). Será efectuada a preparação dos homogenizados das artérias dos diferentes grupos em estudo e determinados, por SDS-PAGE e Western blotting, os níveis de expressão da sintetase do óxido nítrico endotelial (enos) e os níveis de expressão da nitrotirosina (reflecte produção aumentada de peroxinitrito) (8) Determinação imunocitoquímica de AGEs, MCP-1, VEGF e HIF-1 α na parede vascular Técnicas histológicas de coloração para avaliar a estrutura da parede da artéria aorta e renal para identificação de fibrose, proteoglicanos, fibras elásticas e deposição de lípidos serão realizadas (Hematoxilina-Eosina, Pentacrómio de Movat e Red Oil). Técnicas imunocitoquímicas com anticorpos específicos contra os AGEs, a proteína quimioatractora de monócitos - MCP-1, o factor de crescimento vascular VEGF ou o HIF-1 serão utilizadas para avaliar os seus níveis e distribuição na parede arterial (10). 3. RESULTADOS ESPERADOS: Prevê-se que administração de metilglioxal nos permita obter um bom modelo animal para o estudo da aterosclerose diabética e que os suplementos de metformina e piridoxamina possam melhorar o desequilíbrio metabólico e o perfil lipídico, ao aumentar directa e/ou indirectamente a capacidade anti-oxidante, contribuir para a prevenção de algumas das complicações da diabetes. 5. BIBLIOGRAFIA 1) Landmesser U, Hornig B, Drexler H. Circulation 2004;109:II Creager MA, Luscher TF, Cosentino F, Beckman JA. Circulation 2003;108: Du X, Matsumura T, Edelstein D, et al. J Clin Invest 2003;112: Brownlee M. Nature 2001;414: Ceriello A, Motz E. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004;24: ) Dotsch J, Knerr I, Rascher W, Meissner U. Eur J Endocrinol 2006;154: ) Lutsenko EA, Cárcamo JM, Golde DW. J Biol Chem 2002;277: ) Bitar MS, Wahid S, Mustafa S, et al: Eur J Pharmacol 2005;511: ) Miller FJ, Gutterman DD, Rios CD, et al. Circ Res 1998;82:
5 10) Tomita H, Egashira K, Kubo-Inoue M, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol1998;18: (fases, objectivos, metodologias, resultados de cada fase, calendarização, etc.) Competências específicas do projecto a adquirir pelo aluno: Formular hipóteses relativamente aos AGEs e sua importância na aterosclerose diabética, compreender a sua potencial importância na prática clínica. Perspectivar este projecto científico relativamente ao actual estado de conhecimentos nesta área. Compreender como se planeiam experiências científicas in vivo e in vitro e desenhar os seus protocolos experimentais específicos. Interpretar os resultados e compará-los com a hipótese inicial para decidir qual o rumo a tomar e quais as experiências que faltam para confirmar a hipótese inicial ou formular uma nova. Saber interpretar e tratar os seus resultados, elaborar gráficos e fazer o tratamento estatístico dos resultados obtidos. Conseguir perceber a importância de fazer mais experiências para aumentar o número de observações e conseguir observar diferenças estatisticamente siginificativas. Conseguir expôr oralmente os seus resultados e perspectivá-los relativamente ao actual estado da literatura para elaborar um artigo científico. (Entre outros requisitos, os alunos deverão ser capazes de formular uma hipótese científica; ser capazes de desenhar um projecto científico e identificar a sua relevância face ao estado do actual do conhecimento; saber desenhar experiências científicas aplicando protocolos específicos; saber interpretar e discutir de forma crítica os resultados obtidos; descrever e expor oralmente os resultados obtidos.) 5
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