VIABILIDADE CELULAR. Figura 1: hipoclorito de sódio
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- Sílvia Amanda do Amaral Arantes
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1 VIABILIDADE CELULAR A aterosclerose é uma doença vascular, progressiva, multifatorial, inflamatória e crônica. Resultante de um desequilíbrio no metabolismo lipídico e uma resposta inflamatória mal adaptativa, caracteriza-se pela proliferação celular excessiva na região subendotelial de grandes e médias artérias. As células envolvidas na progressão da lesão aterosclerótica são expostas a vários tipos de agentes agressores. Um destes agentes são as espécies reativas ao oxigênio, que causam injúrias ao endotélio, iniciando sinalizações para o recrutamento de células leucocitárias, como monócitos, que invadem o espaço subendotelial e se diferenciam em macrófagos e amplifica o processo inflamatório local. Um agente oxidante em contato direto com as células pode ser citotóxico, dependendo da concentração e do tempo de exposição. Um exemplo é o hipoclorito de sódio (NaClO), que é um produto de utilização tanto doméstica, como desinfetante a 2%, quanto em procedimentos endodônticos como anti-séptico em solução a 0,5%. Portanto, a diluição do NaClO pode interferir em sua atividade citotóxica. Figura 1: hipoclorito de sódio Ensaios de citotoxicidade ou viabilidade celular têm o objetivo de testar a atividade citotóxica de vários tipos de compostos, soluções e materiais em diferentes tipos celulares. Os principais tipos utilizados em ensaios de viabilidade celular no estudo da aterosclerose são as linhagens celulares endoteliais (HUVEC) e monócitos diferenciadas em macrófagos (THP-1). O teste do MTT {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium]} é um teste colorimétrico usado para avaliar a viabilidade celular. Desidrogenases mitocondriais, presentes apenas em células metabolicamente viáveis, clivam o anel de tetrazólio, transformando-se de um composto de coloração amarela em um composto de coloração azul escuro, chamado de formazan {E,Z- 1-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-1,3-diphenylformazan}, que são cristais insolúveis em soluções aquosas. Assim sendo, a produção de formazan reflete o estado funcional da cadeia respiratória.
2 Figura 2: MTT. Transformação do MTT em Formazan. OBJETIVO Avaliação da atividade citotóxica de NaClO nas linhagens celulares HUVEC e THP-1. PROCEDIMENTOS Contagem de células: 1) No primeiro dia, as células serão semeadas em placas de 96 poços utilizando uma densidade 1x10 5 células e incubadas por 24 horas em 100uL de meio de cultura. 2) Observação no microscópio invertido para avaliação da adesão e confluência (identifique e desenhe a célula visualizada). 3) Calcular o volume necessário do hipoclorito de sódio de forma a obter as concentrações finais 0,5mM e 1,0mM. Estoque: 1,34mM
3 0,5mM 1mM Transformar concentração em Volume: 0,5mM 1mM 4) Adicionar a quantidade calculada do NaClO nos poços indicados. Completar o volume com meio de cultura para 200uL. Sem NaClO 0,5mM NaClO 1,0 NaClO ul NaClO ul Meio cultura Volume final 5) Voltar à incubação por 1 hora. 6) Acrescentar 22uL de MTT (5 mg/ml) e voltar à incubação por 2 horas. 7) Retirar todo o sobrenadante e adicionar 100uL de DMSO, para dissolução do precipitado. 8) Homogeneizar em shaker por 5 minutos. 9) Analisar em leitor de placa de ELISA com comprimento de onda de 550nm. Os cristais de formazan serão analisados na leitora de placas, onde será avaliada a citotoxicidade do NaClO em células envolvidas no processo de aterosclerose. A Anote neste modelo de placa o seu experimento:
4 B C D E F G H linhagem celular letra/nº do poço [NaClO] Vol. NaClO Vol. de M de cultura t de incubação linhagem celular letra/nº do poço [NaClO] Vol. NaClO Vol. de M de cultura t de incubação linhagem celular letra/nº do poço [NaClO] Vol. NaClO Vol. de M de cultura t de incubação Resultados: Controle [0,05mM] [0,1mM] Obs Resultado1 Resultado 2
5 Resultado 3 Média Escreva seus resultados. Compare as médias das amostras controle (sem tratamento) com as médias das concentrações [0,5mM] e [0,1mM].
6 Discussão: 1) Qual a relação entre a concentração das soluções e a viabilidade celular? 2) Por que foram feitos experimentos em triplicata? 3) Apresente seus resultados para o outro grupo. 4) Descreva e discuta as semelhanças e/ou diferenças com a linhagem celular estudada pelo outro grupo.
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