COMER OU NÃO COMER? EIS A QUESTÃO! O PAPEL DA AUTOFAGIA A BIOLOGIA TUMORAL

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1 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Laboratório de Sinalização e Plasticidade Celular COMER OU NÃO COMER? EIS A QUESTÃO! O PAPEL DA AUTOFAGIA A BIOLOGIA TUMORAL Msc. Eduardo Cremonese Filippi Chiela - - I

2 Autofagia... O QUE É? COMO FUNCIONA? QUAL A FUNÇÃO?

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4 AUTOFAGIA = MECANISMO DE MORTE CELULAR? NÃO

5 MORTE AUTOFÁGICA AUTOFAGIA

6 O BOOM da autofagia...

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8 AUTO (próprio) + FAGIA (alimentar-se de) Processo homeostático catabólico de quebra de componentes celulares próprios através da via lisossomal DANIFICADOS * autofagocitose / autodigestão ENVELHECIDOS (MENOS FUNCIONAIS) MAL-FORMADOS FISIOLÓGICA BENÉFICA CONSERVADA EVOLUTIVAMENTE

9

10 i. Agente Indutor ii. Contexto iii. Intensidade e conteúdo autofagocitado iv. Tempo de indução vs ~90%

11 autofagossomos pró-núcleo 1 pró-núcleo 2

12 AUTOFAGIA FISIOLÓGICA desenvolvimento embrionário

13 Autofagia Fisiológica Processos e Mecanismos nos quais a autofagia exerce alguma função Desenvolvimento Remodelagem tecidual Diferenciação celular Sobrevivência celular AUTOFAGIA Envelhecimento Metabolismo celular Morte Celular

14 Autofagia Fisiológica Principais indutores de autofagia AGREGADOS PROTÉICOS PRIVAÇÃO DE NUTRIENTES E OXIGÊNIO DANO EM ORGANELAS AUTOFAGIA TOXINAS e MICROORGANISMOS COMPOSTOS QUÍMICOS

15 Família Atg: Autophagyrelated genes Coordenam o processo autofágico ATP Substratos para a célula

16 p62: marcadora de lixo intracelular - AUTOFAGIA SELETIVA

17 MODULAÇÃO DA AUTOFAGIA AUTOFAGIA

18 MODULAÇÃO DA AUTOFAGIA Vias/Sinais de Ativação da Proliferação A A Via/Sinal de Inibição da Proliferação Via/Sinal de Inibição da Proliferação A A A AUTOFAGIA

19 A AUTOFAGIA PODE DEGRADAR COMPONENTES ESPECÍFICOS DA CÉLULA A. MITOFAGIA - Mitocôndrias B. PEXOFAGIA* - Peroxissomos C. RETICULOFAGIA Retículo Endoplasmático D. NUCLEOFAGIA* Porções Nucleares (ou núcleos inteiros) E. AGREGADOS PROTÉICOS marcados pela proteína p62 F. LIPOFAGIA Membranas e outros pequenas moléculas lipídicas * bem descritos em leveduras, pouco conhecidos em eucariotos multicelulares

20 MITOFAGIA RETICULOFAGIA

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23 Expressão reduzida em PARKINSON Acúmulo de mitocôndrias defeituosas + aumento de ROS

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25 A AUTOFAGIA DEGRADA COMPONENTES DE MODO TEMPO-DEPENDENTE

26 AUTOFAGIA E CÂNCER

27 AUTOFAGIA: Oncogênico ou Supressor Tumoral? PROCESSO ONCOGÊNICO

28 i. Sobrevivência durante privação de nutrientes e oxigênio (Ex.: células internas de tumores sólidos) ii. Sobrevivência durante quimioterapia (Ex.: ATP para reparo de DNA) iii. Prevenção de apoptose (Ex.: eliminação de mitocondrias próapoptóticas)

29 i. Manutenção da estabilidade genética ii. Controle do ciclo celular e indução de senescência iii. Morte Autofágica (Ex.: quimioterapia e radiação)

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31 AUTOFAGIA COMO MECANISMO SUPRESSOR TUMORAL Animais Animais Tipos de tumores desenvolvidos i. Linfomas de Células B (7) ii. Linfoma de células jovens (1) iii. Carcinoma Hepatocelular (7) iv. Linfoma de célula B (1) v. Adenocarcinoma Pulmonar (1)

32 AUTOFAGIA COMO MECANISMO SUPRESSOR TUMORAL

33 AUTOFAGIA E APOPTOSE AUTOFAGIA E ESTRESSE OXIDATIVO AUTOFAGIA E CICLO CELULAR

34

35 AUTOFAGIA E REPARO AO DNA AUTOFAGIA E SENESCÊNCIA AUTOFAGIA E DANO AO DNA

36

37 Autofagia como ALVO TERAPÊUTICO em câncer?

38 MODULAÇÃO FARMACOLÓGICA DA AUTOFAGIA - ATIVAÇÃO INIBIDORES ATIVADORES ATIVADORES RAPAMICINA AUTOFAGIA

39 Autofagia como ALVO TERAPÊUTICO em câncer? MODULAÇÃO FARMACOLÓGICA DA AUTOFAGIA - INIBIÇÃO WORTMANNIN 3-METILADENINA (3MA) BAFILOMICINA CLOROQUINA x x x H + H + H + H + H + x x x ATP

40 MODULAÇÃO FARMACOLÓGICA DA AUTOFAGIA - TERAPIA Desbalanço Energético + Falha Estrutural + Dano Oxidativo X CLOROQUINA Substratos para a célula MORTE CELULAR x ATP

41 Autofagia como ALVO TERAPÊUTICO em câncer? 2006 = 9 agentes citotóxicos indutores de autofagia AUTOFAGIA = TOXICIDADE

42 2011 = 22 agentes citotóxicos indutores de autofagia 9 CITOTÓXICOS 12 CITOPROTETORES 1 BYSTANDER

43 2013 = 50 agentes citotóxicos indutores de autofagia 15 CITOTÓXICOS 35 CITOPROTETORES

44 Indutores de Autofagia % de Autofagia Citoprotetora % 22 54% 50 70%

45 TRIALS CLÍNICOS UTILIZANDO INIBIDORES DE AUTOFAGIA Desbalanço Energético + Falha Estrutural + Dano Oxidativo X CLOROQUINA HIDROXICLOROQUINA Substratos para a célula MORTE CELULAR x ATP

46 TRIALS CLÍNICOS UTILIZANDO INIBIDORES DE AUTOFAGIA DANO AO DNA =?

47

48 METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA

49 METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA MICROSCOPIA ELETRÔNICA

50 LC3-GFP METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA LC3 I GFP LC3 II GFP GFP

51 WESTERN BLOT LC3 I/II RAPAMICINA 3-METILADENINA BAFILOMICINA CLOROQUINA LC3I LC3II FLUXO AUTOFÁGICO

52 WESTERN BLOT p62 FLUXO AUTOFÁGICO

53 E QUANTO AOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS ATG???

54 A A E QUANTO AOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS ATG??? Não indicam o FUNCIONAMENTO do mecanismo

55 METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA mrfp-gfp-lc3 (autofagossomo) mrfp-gfp-lc3 (autofagolisossomo)

56 mrfp-gfp-lc3 METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA TEMPO

57 Laranja de Acridina (AO) METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA

58 METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA AO Fluorescência verde (toda célula, exceto compartimentos ácidos) Fluorescência vermelha (apenas compartimentos acídicos) Sobreposição

59 METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA AO Fluorescência Verde Sobreposição Fluorescência Vermelha

60 METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA LC3-GFP mrfp-gfp-lc3 Laranja de Acridina (AO) mrfp-lc3

61 CO-MARCAÇÃO FLUORESCENTE - Proteínas de fusão - Marcadores químicos - Imunocitoquímica METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA VERDE = LC3-GFP VERMELHO = MITOCÔNDRIAS (proteína da cadeia respiratória-rfp) VERDE = LC3-GFP VERMELHO = LISOSSOMOS (Lisotracker )

62 MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA?

63 MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA Manipulação GENÉTICA RNA de interferência 3FASES ATGs NENHUM Atg é FUNDAMENTAL à autofagia

64 MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA MODULAÇÃO FARMACOLÓGICA DA AUTOFAGIA - INIBIÇÃO WORTMANNIN 3-METILADENINA (3MA) BAFILOMICINA CLOROQUINA x x x x x

65 MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA MODULAÇÃO FARMACOLÓGICA DA AUTOFAGIA - ATIVAÇÃO INIBIDORES ATIVADORES ATIVADORES RAPAMICINA AUTOFAGIA

66 A Inibição pelo 3MA MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA 3h x 3-METILADENINA (3MA)

67 A Inibição pelo 3MA MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA

68 MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA

69 DIFICULDADES EXPERIMENTAIS EM AUTOFAGIA i. INSTABILIDADE / DINAMISMO - autofagossomo: min de vida! ii. SUSCEPTIBILIDADE A CONDIÇÕES EXTERNAS - ph - estresse mecânico - temperatura - O 2 iii. POUCO CONHECIMENTO MOLECULAR - Ex.: 3-MA iv. PAPEL DUAL DA AUTOFAGIA NO ORGANISMO DIFICULDADE TRANSLACIONAL

70

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72 O DESENVOLVIMENTO TUMORAL CARCINOGÊNESE M1.1 CARCINOGÊNESE MORTE CELULAR SENESCÊNCIA (parada na proliferação) M1.2 (mutação não-oncogênica) DIFERENCIAÇÃO Eliminam 1 CÉLULA PRÉ- TUMORAL por HORA! MECANISMOS ANTITUMORAIS ENDÓGENOS M1, M2, M3 e M4 = mutações oncogênicas, = núcleos em mitose normal,, = núcleos em mitose anormal (INSTABILIDADE GENÉTICA) = proteínas alteradas em células tumorais (ONCOGENES) Obrigado! OBRIGADO

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