Disciplina Biologia Celular

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1 Disciplina Biologia Celular Profª Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva Curso de Biotecnologia FISMA / FEA Aula 3: Tecnologia da Biologia Celular Parte II Bio Cel Profª Cristina 1

2 1- Citoquímica Estudo da localização celular das substâncias que compõem as células Preparações + Microscopia (Óptica e Eletrônica) Produto da reação = corado Produto da reação = eletrodenso Lei de Lambert-Beer : Intensidade de cor é proporcional a concentração da substância em estudo Dosagem por citofotômetro ou histofotômetro 2

3 1.1- Técnicas de identificação e dosagem Substância Investigada Técnica Características DNA Reação de Feulgen 1º HCl aquecido 2º Reativo de Schiff (= Fucsina básica descorada por anidro sulfuroso) RNA Duas preparações paralelas 1º Tratamento com RNAse (com apenas 1 das duas lâminas) 2º Coloração com azul toluidina Catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) Proteínas Reação fluorescente Millon (Tirosina) Diaminoazobenzeno ( Triptofano) Sakaguchi (Arginina) 1º formoldeído Coram aas específicos Não distingue uma proteína da outra Polissacarídeos PAS (periodic acid Schiff) 1º Oxidação pelo ác periódico 2º Reativo de Schiff Enzimas O substrato transformado é imediamante ou posteriomente corado Os cortes não podem ser fixados para manter-s e a estrutura nativa das enzimas 1.2- Microscopia de Fluorescência É geralmente associada à técnicas citoquímicas Substâncias fluorescentes ( subst + luz UV = emissão de fluorescência) Naturalmente (Ex: vit A) Corantes artificiais (Ex: alaranjado-de-acridina) Maior emprego: em combinação com métodos imunológicos Ac conjugados a compostos fluorescentes 3

4 1.3- Localização de proteínas específicas pela imunocitoquímica 1- Imunocitoquímica direta Rato orgão proteína X QUESTÃO: em que céls estão a substância X? ESTRATÉGIA 1 1. Injetar proteína X em coelho = produção de gamaglobulina (Ac) específica para proteína X 2. Coletar sangue do coelho soro 3. Combinar ao Ac uma peroxidase 4. Corte de tecido do órgão do rato + solução de Ac marcados = Ligação 5. Colocar substrato da peroxidase = corante marron 6. Observação no MO ou ME ESTRATÉGIA 2 Conjugar um corante fluorescente ao Ac Observação no MO de fluorescência ESTRATÉGIA 3 Conjugar a ferritina ao Ac Observação no ME ESTRATÉGIA 3 Usar solução de ouro ligada a proteina A a qual liga-se ao Ac Observação no ME Atenção: A técnica de Imunocitoquímica direta não é muito sensível, portanto utiliza-se mais a indireta 4

5 Fotomicrografias de células de carcinoma adenóide cístico coradas com técnicas distintas, obtidas através de microscopia de luz. A imagem superior representa células coradas por imunocitoquímica para receptor de 67 kda da laminina (note-se o arranjo tubular com bicamada epitelial e a grande quantidade de matriz extracelular circundante). A imagem inferior mostra-nos células tratadas com a técnica de imunofluorescência, com proteína (colágeno I) evidenciada por anticorpos fluorescentes. Fonte Imunocitoquímica indireta ESTRATÉGIA 1. Marcação é colocada em um antianticorpo = antigamaglobulina Ag Ac Ag Ac Ag Ac Anti -Ac Peroxidase Ag Ac Anti -Ac 3-3 diaminobenzidina Ag Ac Anti -Ac Peroxidase Precipitado 5

6 A idéia da técnica é semelhante ao esquema, entretanto conduzida em preparados de células ou de tecidos 1.4- Purificação de macromoléculas por cromatografia em coluna Tipos: 1. Interação de troca iônica 2. Interação Hidrofóbica 3. Filtração em gel 4. Interação por afinidade 6

7 1.5- Determinação do tamanho protéico por eletroforese 7

8 1.6- Centrifugação para purificação de organelas celulares Centrifugação fracionada ou diferencial Imagens, esquemas e fotos retirados da internet, através do site: Para estudar: Junqueira, L.C., Carneiro, J. Biologia Celular e Molecular. Guanabara Koogan. 8ª ed Capítulo 2, p

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