Ms. Romeu Moreira dos Santos

Transcrição

1 Ms. Romeu Moreira dos Santos IMUNOVIR

2 INTRODUÇÃO As respostas imunes são úteis de dois modos para diagnosticar uma doença: Inicialmente Acs específicos podem ser utilizados para detectar ou identificar um Ag de interesse. Ou por meio de detecção de Acs específicos no soro, é possível determinar se um animal foi previamente exposto a um agente infeccioso. A mensuração das interações Ag x Ac com o propósito de diagnóstico é denominada sorologia. More PowerPoint resources and downloads available at. 2

3 INTRODUÇÃO As técnicas sorológicas podem ser classificadas em três grandes categorias: Testes de ligação primária Mensura diretamente a ligação do Ag x Ac Testes de ligação secundária Mensura os resultados da interação Ag x Ac in vitro. Testes terciários Compreende os testes in vivo, que mensuram o real efeito protetor dos Acs em um animal. More PowerPoint resources and downloads available at. 3

4 REAGENTES UTILIZADOS EM TESES SOROLÓGICOS Soro Antiglobulinas Anticorpos monoclonais Anticorpos específicos More PowerPoint resources and downloads available at. 4

5 TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA Teste que detectam diretamente o Ag ou Ac de interesse. Permitem o reconhecimento do Ag pelo Ac e os complexos imunes formados são, então, mensurados. Para mensuração desta reação, um dos reagentes deve estar quimicamente marcado More PowerPoint resources and downloads available at. 5

6 TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA Radioimunoensaios Ensaios de imunofluorescência Ensaios imunoenzimáticos Dispositivos descartáveis para imunoensaios Citometria de fluxo More PowerPoint resources and downloads available at. 6

7 HISTÓRICO Utilização de anticorpos em Ensaios Sorológicos : Teste de Imunofluorescência (Weller & Coons); 1959: Radioimunoensaio (Yallow & Berson). Anos 60: enzimas conjugadas a antígenos e anticorpos (Avrameas & Uriel; Nakane & Pierce, 1966). Anos 70: ELISA (Engvall & Perlmann, 1971); produção de anticorpos monoclonais (Kohler & Milstein, 1975) - desenvolvimento de novos testes (kits comerciais). Métodos colorimétricos, radioativos, fluorescentes, quimioluminescentes, etc. More PowerPoint resources and downloads available at. 7

8 RADIOIMUNOENSAIOS São ensaios que utilizam como marcadores radioisótopos (Trício H 3, carbono 14 ou iodo 125) Possuem vantagem de serem altamente sensíveis Desvantagens: alto custo, manipulação do isótopo Aplicabilidade: quantificação de hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos, anticorpos e antígenos microbianos. Radioimunoensaios para anticorpos Radioimunoensaios para antígenos More PowerPoint resources and downloads available at. 8

9 RADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTICORPOS Teste radioalergossorbente (RAST) mensura IgE no soro de animais alérgicos. Discos de celulose + antígeno Discos de celulose + antígeno + anticorpos Presença de radioatividade Lavagem Soro teste Sol. Antiglobulina marcada Anti-IgE Anti-IgE se liga a IgE + Ag More PowerPoint resources and downloads available at. 9

10 RADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTÍGENOS Imunoensaios de competição são baseados no princípio de que o Ag não marcado irá deslocar o Ag radiomarcado dos imunocomplexos. Radioatividade no sobrenadante Quantidade de reagente marcado (Ag ou Ac) quantifica o Ag ou Ac não-marcado na amostra - competição Ac específicos Precipitado proteico More PowerPoint resources and downloads available at. 10

11 RADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTÍGENOS More PowerPoint resources and downloads available at. 11

12 ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível. A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em um microscópio com luz UV (microscópio de fluorescência) Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina TRICT). Tipos: direta, indireta ou sanduíche. More PowerPoint resources and downloads available at. 12

13 ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) Teste direto - pesquisa de antígenos (células ou tecidos) Teste indireto - pesquisa de anticorpos e eventualmente de antígenos Referência para sorodiagnóstico de várias doenças. Vírus, bactérias e protozoários More PowerPoint resources and downloads available at. 13

14 ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) Teste direto - pesquisa de antígenos Ex. Raiva, Vírus da leucemia felina (FELV) More PowerPoint resources and downloads available at. 14

15 More PowerPoint resources and downloads available at. 15

16 ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) Teste indireto - pesquisa de anticorpos e eventualmente de antígenos More PowerPoint resources and downloads available at. 16

17 ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; simples execução; determinação de classes e subclasses de anticorpos Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da fluorescência sob irradiação; subjetividade na leitura; ausência de automação. Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Cor Fluoresceína Verde Rodamina Vermelho Vermelho Texas Vermelho Ficoeritrina 480, 545, Laranja More PowerPoint resources and downloads available at. 17

18 ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; simples execução; determinação de classes e subclasses de anticorpos Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da fluorescência sob irradiação; subjetividade na leitura; ausência de automação. Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Cor Fluoresceína Verde Rodamina Vermelho Vermelho Texas Vermelho Ficoeritrina 480, 545, Laranja More PowerPoint resources and downloads available at. 18

19 ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima (ELISA) Um dos mais importantes imunoensaios empregados na medicina veterinária Utillizado para detectar e mensurar tanto Acs como Ags. More PowerPoint resources and downloads available at. 19

20 ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS - ETAPAS Revista a superfície das cavidades de uma microplaca apropiada com Ags do agente infeccioso que você está interessado em detectar Acs específicos. Adicione as amostras de soro de indivíduos a serem testados, se houver anticorpos na amostra, eles vão se ligar aos Ags adsorvidos à superfície plástica Lave as cavidades da microplaca a fim de remover todos os anticorpos que não forem específicos para o Ag em questão Adicione um outro tipo de Ac anti-ig da espécie que você está pesquisando se as amostras de soro têm ou não que deve ter sido previamente marcado com uma enzima Adicione o substrato específico para a enzima e deixe a reação de degradação enzimática prosseguir e conferir cor às cavidades da microplaca A intensidade da cor (DO) deve ser mensurada em leitor-fotômetro, sendo que as leituras são proporcionais aos níveis dos Acs presentes nas amostras originais de soro contra o Ag em questão. More PowerPoint resources and downloads available at. 20

21 ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS Método direto Ags Método indireto Acs Sandwich e Competitivo Ags e Acs More PowerPoint resources and downloads available at. 21

22 ELISA INDIRETO Antígeno Fonte de proteínas estranhas ao sistema Soro anti Conjugado anti Lavagens More PowerPoint resources and downloads available at. 22

23 ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS Sandwich-ELISA (S-ELISA) / Duplo Ac-ELISA As amostras são adicionadas às cavidades de uma microplaca previamente revestidas com Acs de captura específicos para Ag que se deseja detector As cavidades da microplaca são lavadas p/ remover o excesso de substâncias ou Ags que não se ligaram especificamente aos Acs de captura Uma preparação de Ac secundário conjugado com uma enzima apropriada é adicionada O substrato enzimático é então adicionada e haverá, no caso de presença de Ag na amostra uma mudança de cor, que pode ser mensurada em leitor-fotômetro apropriado. A intensidade de DO é proporcional à quantidade de Ag presente na amostra. More PowerPoint resources and downloads available at. 23

24 ELISA DIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA Soro anti Fonte de proteínas estranhas ao sistema Antígeno Conjugadoanti Lavagens More PowerPoint resources and downloads available at. 24

25 ELISA More PowerPoint resources and downloads available at. 25

26 ELISA More PowerPoint resources and downloads available at. 26

27 IMMUNOBLOTTING (Western blotting) Transferência de proteínas separadas por eletroforese do gel de poliacrilamida para membranas ELISA Resolução obtida pela separação eletroforética de mistura de proteínas + especificidade de anticorpos usados como sondas para a detecção de Ags Suportes: membrans de nitrocelulose (interações hidrofóbicas); nylon, polyvinyldifluoide (PVDF) alta capacidade de ligação a proteínas Quantificação de bandas por densitometria. More PowerPoint resources and downloads available at. 27

28 IMMUNOBLOTTING (Western blotting) More PowerPoint resources and downloads available at. 28

31 IMUNOHISTOQUÍMICA Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais. Anticorpos conjugados com enzimas conversão de substrato incolor em produto colorido (deposição pode ser observada diretamente ao microscópio óptico). Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina, -Galactosidase e Glicose Oxidase. Método direto Acs primários conjugados (antígenos). Método indireto Acs secundários conjugados (antígenos ou anticorpos). Desvantagens: atividade enzimática endógena, armazenamento inadequado dos conjugados. More PowerPoint resources and downloads available at. 31

32 IMUNOHISTOQUÍMICA More PowerPoint resources and downloads available at. 32

33 Imunocromatografia O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana de nitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar a visualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com proteína inerte como nos testes imunoenzimáticos (ELISA). More PowerPoint resources and downloads available at. 33

34 Imunocromatografia More PowerPoint resources and downloads available at. 34

37 Citometria de Fluxo Identificação e separação de células baseadas na dispersão de luz e fluorescência sob feixe de laser Estudo de populações de leucócitos - luz dispersa - tamanho e forma da célula Identificação de populações e/ou subpopulações de linfócitos T e B FACS (fluorescence-activated cell sorter) - separação de uma única célula More PowerPoint resources and downloads available at. 37

38 Citometria de Fluxo More PowerPoint resources and downloads available at. 38