Métodos e estudo em biologia celular e tecidual

Transcrição

1 Métodos e estudo em biologia celular e tecidual CCM 23/04/2015 Nathalie Cella

2 PERGUNTAS FERRAMENTAS

3 Perguntas de Biologia Celular Qual é o aspecto de uma célula? como as células crescem? como as células proliferam? como as células se diferenciam? como as células se comunicam? como as células formam um tecido? como os tecidos formam órgãos? como as célula respondem a agressões? como as células se movimentam? como as células interagem com o meio externo? Do que a célula é composta? Por que/como as células adoecem? como o ovo (zigoto) se torna um organismo multicelular?

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5 Theodor Schwann Matthias Schleiden Rudolf Virchow

6 História da Teoria Celular

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8 ferramentas Imagem bioquímica Biologia molecular computacional

9 Microscopia óptica

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11 Bright filed Phase contrast Differencial-interference-contrast Dark field

12 Processamento de imagem

13 deconvolução e imagem microscopia óptica confocal microscopia óptica convencional

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15 Divisão de uma célula animal

16 Microscopia eletrônica (ME) de transmissão e de varredura

17 Microcscopia eletrônica

18 Estereocílios de uma célula do ouvido interno de um sapo Microscopia óptica ME de varredura ME de transmissão

19 Alvéolo mamário Flor de trigo

20 Célula de levedura

21 Imunogold

22 Como detectar diferentes proteínas e mrnas na célula?

23 Imunização de animais ANTICORPOS

24 imunocitoquímica/imunohistoquímica detecção de moléculas in situ Figure 9-18 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

25 diferentes marcadores DAB fluoresceína

26 detecção de moléculas na célula Vermelho células proliferando Verde proteína V

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29 Detecção de mrna localização da expressão de genes diferentes

30 Dinâmica de proteínas por microscopia óptica

31 FRAP fluorescence recovery after photobleaching

32 Estudo da estrutura e função da proteína SHAKIRA

33 Como estudar esta proteína?

34 evidência correlativa Shakira Schlafen

35 Perda de função supressão da expressão de Shakira (exemplo) aumento da migração aumento da proliferação

36 ganho de função Super-expressão de Shakira aumento da adesão diminuição da proliferação

37 Pele cérebro Intestino Pâncreas glândula mamária glândulas salivares Expressão de Shakira

38 Reduzir para entender..

39 Cultura celular (in vitro) Cultura celular in vitro S um determinado tecido tem vários tipos celulares

40 Isolamento das células que expressam Shakira S S S S Anti-shakira fluoróforo células que expressão Shakira isoladas FACS fluorescence activated cell sorter

41 Isolamento das células que expressam Shakira

42 supressão da expressão de Shakira

43 Interferência de RNA (RNAi) shakira tubulina

44 Shakira tem alguma função na proliferação celular? Ensaio de incorporação de BrdU

45 Shakira tem alguma função na proliferação celular? Imunofluorescência com anti-brdu

46 Shakira tem alguma função na migração celular? time-lapse video-microscopy

47 Shakira tem alguma função na migração celular? Ensaio de fechamento de ferida controle Shakira - controle Shakira - controle Shakira - não é importante na migração é importante na migração células sem Shakira morrem

48 E se as células isoladas não expressarem Shakira?

49 Super-expressão do gene que codifica Shakira COMO?

50 Clonagem de fragmentos de DNA

51 Propagação dos plasmídeos

52 Introdução de DNA em uma célula

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54 Outras perguntas Há alteração da expressão gênica na ausência de Shakira? Há alterações no ciclo celular? Há alterações na morfologia? Há alterações na função celular? Como é animal sem Shakira (knockout)? Como é o animal com Shakira mutada? Que moléculas interagem com Shakira?

55 Gerando todo um organismo geneticamente modificado (OGM)

56 Células-tronco embrionárias DNA exógeno células embrionárias com uma cópia do DNA exógeno

57 injeção das células alteradas Fêmea prenhe embrião embrião híbrido transplante no útero de fêmeas pseudo-prenhes gene alterado nas gônadas (ou seja, na linhagem germinativa)

58 X F X M animais transgênicas com 1 cópia do gene alterado AT AT AA AT AT TT animal homozigoto para o gene alterado

59 Caracterização do fenótipo resultante da alteração de determinado gene

60 E se a alteração resultar em letalidade? Mutações e deleções tecido-específicas

61 Análise das células e tecidos por microscopia controle knockout

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63 normal ( selvagem ) alterados (mutantes ou knockouts) Alteração/ausência de Shakira resulta em letalidade na embriogênese

64 Que proteínas interagem com Shakira?

65 PCR polymerase chain reaction

66 Biblioteca de cdna mrna Transcrição reversa separação das fitas e adição do segundo primer

67 Clonagem de fragmentos de DNA

68 Sistema duplo-híbrido em levedura shakira proteína expressa por um dos clones isca isca presa genes recombinantes são introduzidos em células de levedura presa capturada sítio de ativação de trasncrição transcrição de gene reporter

69 Estudo da estrutura e função da proteína SHAKIRA

70 Shakira altera a expressão de outros genes?

71 Shakira + Shakira -

72 Microarrays de DNA Genes sobre uma lâmina (DNA) mrna de células Shakira + mrna de células Shakira -

73 Análise dos genes alterados em consequência da ausência de Shakira

74 ChIP - chromatin immunoprecipitation Shakira atua diretamente na transcriçãod e genes?

75 Extração proteica

76 Fracionamento celular

77 Figure 8-12 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

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81 SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophresis

82 Detecção de proteínas no gel de eletroforese gel corado pelo Coomassie blue

83 Transferências das proteínas do gel para uma membrana Western blot

84 Imunodetecção (immunoblot) shakira

85 2D-SDS-PAGE

86 2D-SDS-PAGE corado pelo Coommassie blue

87 Imunodetecção após 2D-SDS-PAGE Há 4 tipos de Shakira!!!

88 Espectrometria de massa (MS) Ferramenta analítica para midir a massa de uma molécula Determina a sequência de aminoácidos de uma proteína Detecta alterações pós-traducionais

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90 cristalografia de raio-x determinação da estrutura tridimensional

91 Sequência de aa da Shakira MDALQLANSAFAVDLFKQLCEKEPLGNVLFSPICLSTSLSLAQVGAKGDTANEI GQVLHFENVKDIPFGFQTVTSDVNKLSSFYSLKLIKRLYVDKSLNLSTEFISST KRPYAKELETVDFKDKLEETKGQINNSIKDLTDGHFENILADNSVNDQTKILVV NAAYFVGKWMKKFPESETKECPFRLNKTDTKPVQMMNMEATFCMGNIDSINCKI IELPFQNKHLSMFILLPKDVEDESTGLEKIEKQLNSESLSQWTNPSTMANAKVK LSIPKFKVEKMIDPKACLENLGLKHIFSEDTSDFSGMSETKGVALSNVIHKVCL EITEDGGDSIEVPGARILQHKDELNADHPFIYIIRHNKTRNIIFFGKFCSP Três sítios de fosforilação em resíduos de tirosina (Y)

92 BLAST: Basic Local Alignment Search NCBI - National Center for Biotechnology Information

93 Perguntas que o BLAST responde Que espécies de batérias têm uma proteína relacionada a uma certa proteína cuja sequência de aminoácidos é conhecida? Que outros genes codificam proteínas com estrutura semelhante a uma determinada estrutura de interesse? Que genes no homem se parecem com um determinado gene de camundongo? Blast quickstart

94 Predição de sítios de fosforilação e possíveis enzimas envolvidas

95 Predição de sinal de localização nuclear

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97 Predição de outras alterações pós-traducionais

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99 MODELO de estudo x OBJETO de estudo

100 Modelos de estudo vantagens e desvantagens

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