Seleção de clones e screening de bibliotecas genômicas

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO PÓLO AVANÇADO DE XERÉM GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA CURSO MELH. GEN. E OGMs (XBT353) TURMA 2015/2 Seleção de clones e screening de bibliotecas genômicas Prof. Dr. Silas Pessini Rodrigues Rio de Janeiro, 24 de novembro de 2015

2 Seleção: um tipo de pressão (ex.: presença de anti-biótico) é aplicada sob as células hospedeiras pré-expostas à DNA recombinante à as células contendo o DNA de interesse sobrevivem e são selecionandas. Screening: Uma população de células viáveis é submetida a testes específicos que permitem a identificação de indivíduos da população que contêm o DNA de interesse.

3 Seleção genética e métodos de screening Baseiam-se na expressão ou não de uma determinada característica à codificada pelo vetor ou pelo DNA inserto Principais métodos de screening: 1. Uso de substratos cromogênicos 2. Inativação por inserção 3. Complementação de mutações 4. Hibridização de ácidos nucléicos 5. Reação em cadeia da Polimerase (PCR) 6. Teste imunológico

4 1. Uso de substratos cromogênicos na seleção genética Sistema X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl--Dgalactopyranoside) Subtrato incolor da β-galactosidase (β-gal) β-gal à sintetizada em E. coli na presença de galactose ou indutores (ex.: IPTG, iso-propyl-thiogalactoside) β-gal à codificada pelo gene LacZ Estão associadas também à selecão por antibióticos à o antibiótico seleciona células que receberam o plasmídeo à e o subtrato cromogênico seleciona as que receberam o inserto

5 A clivagem do substrato x-gal gera um produto de cor azul Oxidação no ar

6 Alguns vetores podem trazer o gene LacZ completo (LacZ) ou parcial (LacZ ) Vetor lambda Charon 16A A célula hospedeira que não codifica o gene LacZ (fenótipo LacZ-) à só vai expressar o fenótipo se a célula possuir o vetor

7 LacZ+ Tem o vetor, sem o inserto de DNA! LacZ- Tem o vetor, contendo o inserto de DNA!

8 Alguns vetores podem trazer o gene LacZ completo (LacZ) ou parcial (LacZ ) Plasmídeo puc18 Sistema de α-complementação: N-terminal, tetrâmero à sítio ativo α-peptide à interface entre as duas sub. dos tetrâmeros à resíduos estabilizam as 4 hélices e os resíduos 13 e 15 contribuem para o sítio ativo E. coli β- gal

9 Sistema LacZ de complementação com α-peptídeo

10 Inativação por inserção: o inserto de DNA inativa um gene no vetor Tem o vetor intacto! Tem o vetor + inserto!

11 2. Inativação por inserção: sistema de resistência à antibióticos Inserto aqui Células = Ap Suceptíveis Tc Resistentes

12 2. Inativação por inserção: sistema de resistência à antibióticos Inserto aqui Ap R Células = Ap Suceptíveis Tc Resistentes Células de interesse!

13 3. Complementação de mutações Complementação: o DNA clonado codifica uma função auxente na célula hospedeira Requerimentos: 3.1 Uma cepa de hospedeiro mutato em um gene particular (auxotrófico) 3.2 Um meio de cultura específico para seleção da cepa mutada 3.3 A forma funcional do gene, para ser inserida junto com o vetor de expressão Hospedeiro auxotrófico: incapaz de sintetizar um composto particular requerido para o seu crescimento

14 Microalga Chlamydomonas reinhardtii auxotrófica para o Arginina Células em meio sem arg ou não transformadas Células em meio com arg ou transformadas C. reinhardtii Cc1618- falta um gene de síntese de arginina (arg)

15 Outros métodos de seleção genética ci intacto à forma lisógenos ci + inserto de DNA à célula sofrem lise à formam placas bacterianas Sistema repressor ci de fago lambda Genes que controlam a mudança entre os ciclos lisogênico e lítico: ci repressor do ciclo lítico Cro controla o repressor e outros genes à induz ciclo lítico Ex.: vetor λgt10

16 Apenas células infectadas por vetor+inserto formarão placas bacterianas (regiões de ciclo lítico), quando suspensões diluídas de fagos forem aplicadas sobre bactérias Placa bacteriana, de onde bacteriófagos são isolados e podem ser re-cultivados em bactérias crescendo em meio líquido

17 4. Screening por hibridização de ácidos nucléicos Baseadas na complementaridade de ácidos núcleis em dupla fita Envolve o uso de sondas à a sonda apresenta um determinado grau de homologia em relação à sequência alvo As sondas podem ser marcadas com 32 P ou por fluorescência Sonda heterólogas à baseada na sequência de DNA de um organismo, quando aplicada em uma espécie diferente. As sondas são de três tipos: 1) DNA genômico 2) cdna à pode ser utilizada diretamente à partir de uma população de mrna sem a necessidade de clonagem prévia 3) Oligonucleotídeos à sintetizados à partir da sequência da proteína

18 De que forma as sondas podem ser marcadas? - Polimerase incorpora nucleoedeos marcados - Pode uflizar: NucleoEdeos radioafvos NucleoEdeos marcados quimicamente Timina modificada Dioxigenina à pode ser detectada por anticorpo

19 De que forma as sondas podem ser marcadas? - O DNA pode ser tratado com uma 5 kinase

20 4. Screening por hibridização de ácidos nucléicos Estringência: O quanto acurada uma sonda vai ser

21 Placas em alta e baixa densidade são utilizadas para screening O screening é feito em placas com populações densas de células, que são recultivadas para permitirem o isolamento de células individuais

22 Screening imunológico é utilizado na detecção do produto do gene Anticorpo à antígeno Anticorpo polyclonal: reconhecem todos os determinantes atntigênicos de um antígeno Anticorpo monoclonal: reconhecem um único determinante antigênico (muito mais específico e difícil de se obter) Utilizados para a detecção do produto do gene à são aplicados a bibliotecas de expressão

23 Análise da expressão gênica por imunologia

24 O nível de expressão e o número de vezes que o gene foi inserido no genoma do hospedeiro pode ser determinado por um conjunto de técnicas RT-PCR Blotting Southern-blot alvo são moléculas de DNA Northen-blot alvo são moléculas de RNA Western-blot alvo são proteínas