INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS DE CLONAGEM GÊNICA (PARTE B)

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1 INTRODUÇÃO ÀS TÉCNICAS DE CLONAGEM GÊNICA (PARTE B) Para produzir 5mg de somatostatina, são necessários cérebros de carneiro, ou por engenharia genética 7,5kg de E. coli com gene enxertado deste hormônio. Profa. Leila Larisa Medeiros Marques

2 Etapas da clonagem gênica 1. Obtenção do DNA a ser clonado (digestão); 2. Ligação a vetores de clonagem; 3. Inserção dos vetores em células hospedeiras = clonagem do DNA; 4. Seleção do gene desejado (Screening).

3 1. OBTENÇÃO DO DNA A SER CLONADO 2. Ligação a vetores de clonagem; 3. Inserção dos vetores em células hospedeiras = clonagem do DNA; 4. Seleção do gene desejado (Screening). Etapas da clonagem gênica

4 Para pensar: Procurar um gene dentro de um genoma humano é comparável a procurar uma pessoa sem sobrenome em uma casa sem endereço em uma rua desconhecida em uma cidade não identificada de um país estrangeiro. Solange Farah

5 Etapa 1: digestão do DNA A digestão do DNA é feita através da ação de enzimas sobre a molécula de DNA (rompem as pontes fosfodiéster nas duas fitas). ENZIMAS DE RESTRIÇÃO ou ENDONUCLEASES

6 Etapa 1: digestão do DNA (cont)- Enzimas de restrição Clivam a molécula de DNA através do reconhecimento de seqüências nucleotídicas específicas; Cada enzima de restrição gera uma família única de fragmentos quando cliva uma molécula de DNA específica. As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são divididas em várias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos sítios de reconhecimento e clivagem; Foram originalmente isoladas de procariotos (do sistema enzima de restrição/modificação). Hoje são produzidas por empresas de biotecnologia e são uma das ferramentas básicas em Biologia Molecular e Engenharia Genética.

7 Bacteriófago X enzimas de restrição

8 Enzimas de restrição Um enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva uma cadeia dupla de DNA sempre que identificar uma sequência específica de 4 a 8 pares de bases que seja o local de restrição do enzima. As seqüências reconhecidas apresentam nas duas cadeias complementares sequências idênticas mas invertidas palíndromo.

9 As enzimas de restrição tipo II Fazem parte de um sistema da célula bacteriana denominado sistema de modificação-restrição. Este sistema consiste numa endonuclease de restrição e do seu par, uma metilase de modificação (bases alvo: A ou C). O nome dado a enzima refere-se ao organismo de onde foi isolado. A primeira letra representa o gênero e as outras duas a espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual foi isolado. Sítios de reconhecimento, modificação e clivagem por alguns enzimas de restrição Enzima Local de restrição Organismo de origem EcoRI HindIII Smal Escherichia coli Haemophilus influenza Serratia marcescens

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11 Nomenclatura A nomenclatura desenvolvida foi baseada na abreviação do nome do microrganismo do qual a enzima foi isolada. A primeira letra representa o gênero e as outras duas a espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada.

12 Exemplos EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferência de resistência RI. Hind III é isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III.

13 Utilidade das enzimas de restrição Permite a retirada de um determinado fragmento para posterior ligação a uma outra molécula de DNA; Abertura dos vetores de clonagem.

14 Etapa 1: enzimas de restrição Há dois tipos distintos de clivagens: a) os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqüência específica, gerando extremidades abruptas ou cegas; b) os cortes são feitos simetricamente, porém fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas.

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17 Etapa 1: enzimas de restrição

18 Hidrólise Enzimática da enzima de restrição A hidrólise dá-se ao nível das ligações fosfodiéster Mg 2+ é um cofator essencial, mas pode ser substituído por certos cátions divalentes, como Mn 2+ Hidrólise Enzimática Produtos da hidrólise resultam em extremidades 3 -OH e 5 -P

19 Elaboração de Mapas de Restrição EcoRI BamHI HindIII HaeII EcoRI + HaeII BamHI + HaeII HindI II + HaeII EcoRI + HindIII EcoRI + BamHI BamHI + HindIII É circular Tamanho: 12.0kd

20 Sequenciamento de DNA Entregar exercícios (individualmente).

21 dntp, ou desoxiribonucleotídeo trifosfato

22 Técnica dideoxi dntp ddntp Após a incorporação do ddntp ocorre a inibição da síntese da cadeia.

23 Técnica dideoxi DNA molde Primers DNA polimerase

24 Sequenciamento automatizado

25 Eletroferograma

26 1. Obtenção do DNA a ser clonado (digestão); 2. LIGAÇÃO A VETORES DE CLONAGEM 3. Inserção dos vetores em células hospedeiras = clonagem do DNA; 4. Seleção do gene desejado (Screening). Etapas da clonagem gênica

27 2. Ligação a vetores de clonagem Vetores genéticos: as moléculas de DNA que veiculam a propagação dos fragmentos de DNA de interesse Vetor: uma molécula de DNA que pode aceitar introduções de DNA estrangeiro em regiões não essenciais para a sua multiplicação dentro da célula hospedeira

28 Tipos de vetores de clonagem Variam em função do tamanho do inserto e do local onde ele será inserido: Plasmídeos; Fagos; Cosmídeos; BAC (cromossomo artificial de bacteria); YAC (cromossomo artificial de levedura).

29 Vetores de clonagem: plasmídeos São pequenas moléculas de DNA dupla fita, contendo os elementos necessários para a sua replicação e pelo menos um gene que confere resistência a antibiótico. Variam de 5 a 400 kilobases e comumente estão presentes em duas ou mais cópias por célula. Limite de clonagem:100 a pares de bases

30 Vetores de clonagem: plasmídeos

31 Vetores de clonagem: plasmídeos

32 Requisitos para o vetor de clonagem plasmídeo: a) possuir uma origem de replicação (O), ou seja, uma sequência de DNA que permita que o vetor seja replicado na célula hospedeira, b) apresentar dois ou mais sítios únicos de clivagem para enzimas de restrição. O conjunto destes sítios é denominado de Múltiplo Sítios de Clonagem (MSC) é o local onde o inserto é incorporado ao vetor de clonagem, c) possuir um gene que codifica um produto que distingue a célula transformada da célula não transformada. Por exemplo, muitos vetores de clonagem carregam o gene que confere resistência à ampicilina (Amp R ). As células transformadas com tais vetores são capazes de crescer num meio contendo o antibiótico, enquanto que as células não transformadas acabam morrendo.

33 Estrutura molecular de um plasmídeo típico usado em clonagem molecular

34 Plasmídeos artificiais Construído a partir de plamídeos naturais de E. coli; Ex. pbr322 que contém 2 marcadores de seleção, AMp R e Tet R (genes de resistência à ampicilina e tetracicilina) e apresenta 39 sítios únicos de reconhecimento para diferentes enzimas de restrição, alguns dos quais situados inclusive dentro destes marcadores.

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37 Vetores de clonagem: fagos Os bacteriófagos ou fagos, são vírus que infectam especificamente as bactérias; Tal como todos os vírus, os fagos têm uma estrutura muito simples, consistindo meramente numa molécula de DNA (ou RNA), que transporta determinado número de genes, nos quais se incluem vários para a replicação do fago, rodeado por um invólucro protetor ou uma cápside composta por moléculas protéicas.

38 Vetores de clonagem: fagos Clonagem de fragmentos de DNA de até 15 kb

39 Vetores de clonagem: fagos

40 Vetores de clonagem: fagos Vetores de clonagem: fagos

41 Vetores de clonagem: fagos

42 Vetores de clonagem: fagos Vantagens: Uma das maiores vantagens de usar o fago l como vetor de clonagem é que o DNA inserido no fago é empacotado in vitro; Este processo é altamente eficiente quando comparado com o da transformação bacteriana com plasmídeos.

43 Vetores de clonagem: cosmídeos A clonagem de fragmentos de DNA no fago l apresenta uma limitação na qual o fragmento a ser clonado não ultrapasse cerca de 15kb, por causa da limitação de tamanho imposta pela cabeça da partícula; Na maioria das vezes, esta dimensão é suficiente para conter um gene completo. Entretanto, muitos genes apresentam dimensões da ordem de 35 a 40 kb e nestes casos, a técnica usada para a clonagem deste tipo de fragmento é a chamada clonagem em cosmídeos. COSMÍDEOS: molécula de DNA extracromossômica circular que possui características de plasmídios e de fagos.

44 Vetores de clonagem: cosmídeos limite de clonagem: kb

45 Vetores de clonagem: cromossomo artificial de bacteria BAC (Bacterial Artificial Chromosome) - cromossomo artificial baseado em cromossomos bacterianos. limite de clonagem: kb

46 Vetores de clonagem: cromossomo artificial de levedura YAC (Yeast Artificial Chromosome) - cromossomo artificial que contém telômeros, origem de replicação, centrômero e um marcador para sua identificação em células de levedura. limite de clonagem: até kb

47 Características gerais de vetores de clonagem Designação Tamanho do inserto Descrição Plasmídeo Até 10Kb DNA circular fita dupla Fago (Bacteriófago) Até 20Kb DNA linear fita dupla Cosmídeo Até 40Kb DNA linear fita dupla, que se circulariza para converter a forma de fago em plasmídeo BAC (Cromossomo artificial de bactéria) Até 250Kb DNA circular fita dupla (com sinais de cromossomo bacteriano) YAC (Cromossomo artificial de levedura) Até 2Mb DNA linear fita dupla (com sinais de cromossomo de levedura, como telômeros, centro organizador de nucléolo, etc.)

48 1. Obtenção do DNA a ser clonado (digestão); 2. Ligação a vetores de clonagem; 3. INSERÇÃO DOS VETORES EM CÉLULAS HOSPEDEIRAS = CLONAGEM DO DNA; 4. Seleção do gene desejado (Screening). Etapas da clonagem gênica

49 3. Inserção dos vetores em células hospedeiras = clonagem do DNA Produção de uma grande número de cópias de um mesmo fragmento de DNA, conseguido através da utilização de um vetor, que é inserido em uma célula hospedeira capaz de se multiplicar.

50 3. Inserção de vetores recombinantes em uma células hospedeiras Transformação - a célula hospedeira é tornada competente para o vetor de clonagem ser introduzido; Transfecção ou transdução- quando o vetor de clonagem tem características de vírus, a célula hospedeira pode ser transfectada para inserir a molécula recombinante; Microprojéteis - partículas cobertas com DNA são projetadas contra uma célula e penetram em sua membrana; Eletroporação - a célula é submetida a um campo elétrico que faz com que pequenos poros sejam abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido.

51 3. Inserção de vetores recombinantes em uma células hospedeiras

52 3. Inserção de vetores recombinantes em uma células hospedeiras Competência: incubação das células em baixas temperaturas (gelifica as proteínas das membranas) e adição de cloreto de cálcio (para neutralizar as cargas negativas do DNA) Bactérias competentes + vetores recombinantes submetidos a um choque térmico (estimula a inserção do plasmídeo na bactéria competente hospedeira)

53 3. Inserção de vetores recombinantes em uma células hospedeiras

54 1. Obtenção do DNA a ser clonado (digestão); 2. Ligação a vetores de clonagem; 3. Inserção dos vetores em células hospedeiras = clonagem do DNA; 4. SELEÇÃO DO GENE DESEJADO (SCREENING). Verifica a presença da molécula recombinante nas células da bactérias transformadas. Etapas da clonagem gênica

55 4. DETECÇÃO E ANÁLISE DO CLONE RECOMBINANTE. Um passo crucial na Tecnologia do DNA recombinante é encontrar o clone correto na mistura de clones que foi criada; Embora seja relativamente fácil selecionar as colônias que abrigam os vetores de clonagem usando os marcadores de resistência a antibióticos que estão presentes nos vetores, é muito mais difícil selecionar o clone que contenha o gene de interesse. Note que no caso do vetor ser um plasmídeo deverão ser examinadas milhões de colônias de bactérias crescidas em placas de petri contendo ágar, para a detecção da colônia que produza quantidades da proteína expressa pelo gene de interesse ou então que possua o gene sem qualquer expressão proteica que o caracterize.

56 Seleção das células recombinantes: resistência a antibiótico

57 Seleção das células recombinantes: presença de inserto no plasmídio Inativação insercional: Gene lacz codifica a β-galactosidase, enzima que, atuando sobre o X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactosídeo), dá origem a colônias azuis; a perda da sua função (pela inserção do gene de inserto) faz com que as colônias fiquem brancas.

58 Seleção das células recombinantes: presença de inserto no plasmídio

59 Estudo dirigido 1. O que é clonagem molecular? 2. Quais são as etapas da clonagem gênica? Explique. 3. Explique os sistema de restrição-modificação. 4. O que é biblioteca genômica? 5. Quais as formas possíveis de obtenção do DNA a ser clonado? 6. Quais os pontos fundamentais para a molécula poder ser um vetor de clonagem? 7. Como ocorre a inserção das moléculas de DNA recombinante em um hospedeiro? 8. Explique o método de screening: hibridização de ácidos nucléicos.

60 Referências SERAFINI, L. A.; BARROS, N. M.; AZEVEDO, J. L. Biotecnologia: avanços na agricultura e na agroindústria. Caxias do Sul: EDUCS, Capítulo 1. LIMA, N.; MOTA, M. Biotecnologia- Fundamentos e aplicações. Lisboa: Lidel, Capítulo VII. BORZANI, W. et al. Biotecnologia Industrial. V. 1. Fundamentos. São Paulo: Blucher, Capítulo 4. Vídeo sobre sequenciamento de DNA: Vídeo sobre engenharia genética: