Tecnologia do DNA Recombinante. Tecnologia do DNA Recombinante

Transcrição

1 Tecnologia do DNA Recombinante Tecnologia do DNA Recombinante

2 The Roundup Ready Story Glifosato (Glyphosate) é um herbicida de amplo espectro Ingrediente ativo do herbicida Roundup; Mata todas as plantas com que entra em contato; Inibe uma enzima chave (EPSP synthase) no metabolismo de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano). Planta morre porque faltam aminoácidos Um gene que produz uma enzima resistente (EPSP synthase) ao glifosato permite que as culturas sobrevivam mesmo quando pulverizadas

3 Plantas sensíveis ao Roundup Ácido chiquimico + fosfoenolpiruvato + glifosato X Planta EPSP synthase Sem aminoácidos, planta morre X Ácido 3-Enolpiruvil chiquímico -5-fosfato (EPSP) X X Aminácidos aromáticos

4 Plantas resistentes ao Roundup Ácido chiquimico + fosfoenolpiruvato + Glifosato Bacteria EPSP synthase RoundUp não tem efeito; Enzima é resistente ao herbicida Com aminoácidos, planta vive Ácido 3-Enolpiruvil chiquímico -5-fosfato (EPSP) Aminácidos aromáticos

5 Teste em campo dos transgênicos Resistência a herbicida Milho RoundUp Ready Transgênicos Não-transgênicos Antes Depois

6 Flavr Savr (Calgene) O tomate Flavr Savr, foi desenvolvido pela Calgene, uma companhia de biotecnologia com base em Davis, na Califórnia. Vários anos se passaram até que o FDA aprovasse o transgênico. O FDA não exige aprovação, no entanto a Calgene submeteu voluntariamente o Flavr Savr para aprovação em Em 1994, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos aprovou que este não apresentava risco ao ambiente.

7 Flavr Savr (Calgene) Tomate transgênico Tomate tradicional O tomate transgênico amadurece na planta, ficando com mais sabor. Mantém-se firme após a colheita. O tomate tradicional é vaporizado com etileno para induzir a maturação. SUPERMERCADO O tomate tradicional tem de ser colhido verde, para não ser esmagado durante o transporte.

8 Flavr Savr Gene que amolece o tomate (poligalacturonase) DNA Gene Flavr Savr RNA mensageiro RNA inativado

9 Engenharia genética e Culturas GM Tecnologia do DNA recombinante: permite a transferência direta de um ou alguns genes entre organismos não relacionados ou uma modificação através da remoção de um gene ou ainda alteração na região codante ou no controle da expressão gênica (promotores). "What is most needed are even- handed, case-by-case assessments of the benefits and potential pitfalls of GE in comparison with other crop improvement techniques." Paul Gepts. University of California Davis. Plant Science.

10 Estudo Dirigido 1. Tecnologia do DNA recombinante; 2. Variabilidade Genética e o Melhoramento Genético; 3. Definição de Enzimas de Restrição; 4. Tipos de extremidades que são geradas por enzimas de restrição; 5. Aplicações das Enzimas de Restrição; 6. Vetores e Plasmídios; 7. Características dos Vetores de clonagem; 8. Definição de Transformação Genética; 9. Tipos de transformação genética em Bactérias;

11 Biotecnologia Metodologias chaves que permitiram avanços inéditos: (i) A descoberta de enzimas que modificam as moléculas de DNA de modo que elas posso ser unidas em novas combinações; (ii) A demonstração de que as moléculas de DNA podem ser clonadas, propagadas e expressas em bactérias; (iii) O desenvolvimento de métodos para sintetizar quimicamente e sequenciar as moléculas de DNA ; (iv) O desenvolvimento do método de amplificação do DNA in vitro (reação em cadeia da DNA polimerase). Personal Reflections on the Origins and Emergence of Recombinant DNA Technology Paul Berg and Janet E. Mertz (DOI: /genetics )

12 Tecnologia do DNA Recombinante é um conjunto de ferramentas moleculares (técnicas) que permite aos cientistas identificar, isolar, modificar e multiplicar genes de quaisquer organismos. Enzimas de Restrição e ligação; Vetores; Transformação Genética; PCR; Eletroforese; Bibliotecas Genômicas; Sequenciamento de DNA; Hibridização. Clonagem Molecular Marcadores Moleculares Transgênia

13 1. ENZIMAS DE MODIFICAÇÃO DO DNA: Enzimas de restrição (cortam o DNA em sequências específicas) Enzimas de ligação (ligam sequências de DNA) DNA Recombinante (DNA quimera; construção sintética)

14 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: Proteínas que reconhecem e clivam (CORTAR) a molécula de DNA em sequências específicas, geralmente de 4, 6 e 8 pares de bases (pb) sequências palíndromicas

15 Características: Enzimas de restrição são endonucleases; Enzimas de bactérias; Diferentes linhagens de bactérias produzem diferentes enzimas de restrição; O nome da enzima é derivado do nome da linhagem e espécie bacteriana em que foi isolada; Cortam DNA sempre em sequências definidas e sempre de maneira consistente; Ferramenta básica em clonagem de genes.

16 Nomenclatura: As enzimas de restrição são nomeadas de acordo com a bactéria que a produziu Gênero Exemplo: EcoR I Ordem de descoberta Escherichia Epíteto específico coli Cepa RY 13 1º enzima a ser descoberta nesta bactéria

17 A ligação fosfodiéster é quebrada entre as bases específicas, uma em cada fita de DNA. EXTREMIDADES COESIVAS

18 Algumas enzimas geram extremidades protuberantes 5 (5' overhangs) - EcoRI Algumas enzimas geram extremidades protuberantes 3 (3' overhangs) - PstI Algumas enzimas geram extremidades abruptas (blunt ends)- SmaI

19 Sistema de restrição/modificação Mecanismo de defesa presente quando da entrada de DNA de fago na célula Combinação de enzimas de restrição com metilases hidrólise do DNA estranho proteção do DNA celular relativamente as enzimas de restrição através da adição de grupos metil às bases A ou C DNA metilase possui a mesma sequência de reconhecimento que os enzimas de restrição

20 Sistema de restrição/modificação

21 GAATTC CTTAAG G AATTC CTTAA G EcoRI GAATTC CTTAAG G AATTC CTTAA G G CTTAA EcoRI sticky end G AATTC CTTAA G DNA Ligase G AATTC CTTAA G DNA recombinante AATTC G EcoRI sticky end Juang RH (2004) BCbasics

22 2. VETORES: cromossomo plasmídeos cromossomo plasmídeos Divisão celular ocorrem naturalmente em algumas bactérias; são moléculas de DNA dupla fita e circular; muitas vezes carregam genes para resistência a antibióticos; replicação independente da replicação cromossômica (apresentam uma origem de replicação independente).

23 CONJUGAÇÃO BACTERIANA

24 Vetores de clonagem Plasmídeos modificados que permitem a construção de um DNA recombinante devem apresentar origem de replicação; devem apresentar um gene para seleção (gene para resistência a antibiótico); devem apresentar múltiplos sítios de clonagem (poli-linker)

25 Origem de replicação Genes para resistência a antibióticos Permite que a célula hospedeira cresça em meio seletivo Múltiplos sítios de clonagem Permite a inserção de DNA exógeno

26 Poli-linker (sítio múltiplo de clonagem)

27 Enzima de Restrição EcoRI EcoRI DNA de interesse EcoRI Enzima de Ligação Vetor de clonagem Extremidades coesivas Ligação DNA recombinante

28 3. TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA: Uma geração: 20 minutos

29 Transformação: introduzir DNA dentro da célula bacteriana Transformação química Eletroporação

30 Transformação química: Cálcio + choque térmico

31 Eletroporação cuveta Suspensão de células eletrodo eletrodo

32 MC + ampicilina Células transformadas Clones resistentes a ampicilina Células controle (não transformadas) Clones sensíveis a ampicilina

33 Prepara a construção sintética Clones recombinantes Transformação Célula de E.coli Meio seletivo

34 CLONAGEM MOLECULAR DNA Enzima de restrição Célula humana Gene de interesse DNA Vetor Enzima de restrição Vetor de clonagem

35 3. ELETROFORESE: Eletroforese de DNA

36 Eletroforese

37 5ul

38 Mapa de Restrição Enzimas de restrição C A B A+B M A B 10 kb A 8 kb 2 kb B 7 kb 3 kb A + B 5 kb 3 kb 2 kb Juang RH (2004) BCbasics

39 Aplicação Cromossomos homólogos contém DNA que codifica par os mesmos genes. Neste exemplo, os dois cromossomos tem os mesmos genes nas mesmas posições (representados pelas tiras coloridas), mas versões diferentes desse genes (representados pelas tonalidades diferentes de cada cor). Cromossomos homólogos Regiões homólogas codificam para o mesmo gene Cromátides irmãs

40 Aplicação Sítio para a enzima d restrição EcoRI Indivíduo 1 Gene A Homólogo 1 Homólogo 2 3 kb 2 kb 1 kb 3kb 2kb 1kb Indivíduo 2 Gene a Homólogo 1 Homólogo 2 3 kb 3 kb 3kb

41 Estudo Dirigido 1. Tecnologia do DNA recombinante; 2. Variabilidade Genética e o Melhoramento Genético; 3. Definição de Enzimas de Restrição; 4. Tipos de extremidades que são geradas por enzimas de restrição; 5. Aplicações das Enzimas de Restrição; 6. Vetores e Plasmídios; 7. Características dos Vetores de clonagem; 8. Definição de Transformação Genética; 9. Tipos de transformação genética em Bactérias;

42 "The emergence of recombinant DNA technology occurred via the appropriation of known tools and procedures in novel ways that had broad applications for analyzing and modifying gene structure and organization of complex genomes. Although revolutionary in their impact, the tools and procedures per se were not revolutionary. Rather, the novel ways in which they were applied was what transformed biology." Paul Berg and Janet E. Mertz (Personal Reflections on the Origins and Emergence of Recombinant DNA Technology, DOI: /genetics )

43 ..nothing in the man-made world rivals the complexity and diversity of this earth s organisms. No man-made information system invented to date comes anywhere close to containing the amount of information encoded in their genomes or encompassing the complexity of the intricate machinery for their functioning. We have learned enough to reveal how much we do not know and to acknowledge that nature s secrets are not beyond our capabilities of discovery... Paul Berg and Janet E. Mertz (Personal Reflections on the Origins and Emergence of Recombinant DNA Technology, DOI: /genetics )

44 Histórico do Uso de Tecnologias em Plantas Mutações induzidas por químicos e/ou radiação aumentar a frequência de variação genética. Mutant variety database rice has registered 824 varieties, barley (312), wheat (274), maize (96), common bean (57), tomato (20), potato (16), sugarcane (13), soybean (2) Tecnologia de sementes híbridas para gerar plantas heterozigotas com melhor desempenho produtivo e resistente a pragas e doenças. Sementes hibridas e Linhagens puras Parental 1 X Parental 2 F1 F2 Hibrido Hibridização Repetições de auto-polinização e seleção F3 F4 F5 F6 Linhagem Pura Estável

45 Cultura de tecidos Cultivo de células de plantas, tecidos ou órgãos em meio de cultura especialmente formulados. Em condições apropriadas uma planta inteira pode ser regenerada. Micropropagação é um método de cultura de tecidos desenvolvido para a produção de material vegetal livre de doenças e para a rápida produção de muitas plantas de maneira uniforme. Células meristemáticas são cultivadas em meios de cultura especiais e tradadas com hormônios vegetais para produzir plantas similares.

46 Melhoramento em base em seleção assistida por marcadores moleculares Localizar marcas (sequências de DNA) localizadas próximas a genes que codificam características desejáveis (marcas moleculares ligadas a genes de interesse) que segregam juntas na progênie mapa de ligação genética. molecular marker-assisted breeding, an agricultural biotechnology tool is already a routine step in breeding of most crops where the gene and the markers for a specific trait are known.