Nome: Curso: Nº. 1 º Teste Engenharia Genética 22 de Novembro de 2012 Duração: 2h.

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1 1 Nome: Curso: Nº 1 º Teste Engenharia Genética 22 de Novembro de 2012 Duração: 2h. As proteínas sensoras dos sistemas reguladores de dois components são usadas por bactérias para detectar e responder a alterações ambientais. A bactéria Pseudomonas aeruginosa PA14 tem pelo menos 60 dessas proteínas sensoras que contribuem para a sua enorme capacidade de adaptação a múltiplos ambientes incluindo o humano. Peixes da espécie Danio rerio são usadas como modelo de infecção para Pseudomonas pois estas bactérias são capazes de estabelecer infecções agudas causando a morte do animal. 1- Suponha que dispõe de mutantes por transposição em cada uma das 60 proteínas sensoras. Diga como pode avaliar o grau de virulência desses mutantes, descrevendo a experiência, incluindo o(s) controlo(s) e o tipo de resultados que espera obter. (1,0 valor) 2- Da experiência anterior identificou-se o gene kinb como sendo importante na virulência de Pseudomonas aeruginosa PA14. Sabendo que a sequência de nucleótidos do genoma deste organismo é conhecida, pode-se facilmente obter a sequência de nucleótidos e de aminoácidos de KinB. Explique como pode prever in silico a localização celular desta proteína bem como a existência de domínios conservados. (1,0 valor)

2 2 3- De seguida, pretende confirmar a atenuação da virulência do mutante de transposição para kinb, mas usando um mutante de eliminação. Para tal, pode usar o vector pk18mob (lacz +, mob +, canamicina R ) e a cassete aacc1 (gentamicina R ) para o construir. a) Descreva todos os passos para a clonagem, no vector indicado, das regiões flanqueantes do gene kinb e cassete de substituição. (1,5 valores) b) A transformação de P. aeruginosa PA14 com a molécula de DNA recombinante preparada em a) pode ser efectuada por electrotransformação. Descreva o princípio teórico desta técnica e o modo como faria a selecção das colónias recombinantes. (1,0 valor)

3 3 c) Como poderá confirmar o mutante de eliminação para o gene kinb através do uso da técnica de hibridação de Southern? (2,0 valores) 4- Para confirmar que a atenuação da virulência do mutante de eliminação construído se deve exclusivamente à ausência deste gene, é necessário efectuar uma experiência de complementação in trans. a) A primeira decisão a tomar é a escolha de um vector de clonagem apropriado. Quais são as características que esse vector deverá conter atendendo a que pretende produzir a proteína KinB em P. aeruginosa? (1,0 valor)

4 b) Descreva a clonagem do gene kinb no vector referido em 4a). (1,5 valores) 4 c) Que experiência faria e qual o resultado que deve obter para demonstrar que o mutante de eliminação para kinb não apresenta qualquer outra mutação. (1,0 valor) 5- Sendo uma proteína sensora, KinB autofosforila num resíduo de histidina antes de efectuar a transdução de sinal para a proteína reguladora de resposta. Para confirmar que H385 é o alvo directo de autofosforilação, este aminoácido foi substituído por uma alanina usando técnicas de mutagénese dirigida. Refira qual o material biológico necessário e quais os principais passos do procedimento experimental até à correcta identificação do gene alterado. (2,0 valores)

5 5 6- Testou-se o efeito da mutação do gene kinb na produção do pigmento piocianina e de elastase. Os resultados encontram-se nos seguintes gráficos: a) Qual a importância da proteína KinB em ambos os fenótipos testados? (1,0 valor) b) Qual o efeito da modificação do resíduo de histidina H385A de KinB em ambos os fenótipos? (1,0 valor) 7- Seleccione a resposta correcta através de um círculo (0,5 valores cada): 1- No processo de inactivação por inserção: a) Se houver inserção de um fragmento de DNA, o gene da beta-galactosidase fica inactivo e as colónias de E. coli mantêm-se brancas b) Se houver inserção de um fragmento de DNA, o gene da beta-galactosidase fica inactivo e as colónias de E. coli tornam-se azuis c) Se houver inserção de um fragmento de DNA, o gene da beta-galactosidase fica activo e as colónias de E. coli mantêm-se brancas d) Se houver inserção de um fragmento de DNA, o gene da beta-galactosidase fica activo e as colónias de E. coli tornam-se azuis

6 2- A função da transcriptase reversa na clonagem de DNA eucariótico em células procarióticas é: a) Sintetizar cdna a partir de mrna eucariótico b) Processar o precursor do mrna c) Sintetizar mrna a partir de DNA d) Sintetizar DNA bacteriano a partir de DNA eucariótico 6 3- Para que uma sonda de DNA hibride é necessário que: a) As cadeias de DNA alvo sejam homólogas, tendo regiões com sequências iguais ou semelhantes b) As cadeias de DNA alvo sejam fragmentadas por uma exonuclease c) As cadeias de DNA alvo não sejam homólogas d) O DNA alvo seja complementar ao RNA 4- Durante a reacção de PCR, a Taq polimerase inicia a síntese de DNA: a) No final das cadeias simples de RNA b) Em qualquer cadeia aberta c) Em iniciadores de RNA ligados ao gene de interesse d) Em iniciadores de DNA ligados ao gene de interesse 5- Para que a amplificação de DNA ocorra qual dos seguintes compostos tem de estar presente? a) Ribonucleótidos b) Iniciadores de RNA c) Desoxinucleótidos d) Primase 6- Considere a sequência 5 ATGCCTGGACCTTAACGCGCCTAGGTATCTTGA3. Suponha que necessita de iniciadores 10-mer para PCR. Essas sequências serão: a) ATGCCTGGAC e GGTATCTTGA b) ATGCCTGGAC e TCAAGATACC c) TACGGACCTG e TCAAGATACC d) ATGCCTGGAC e CCATAGAACT 7- Uma bactéria capaz de obter DNA livre a partir do meio externo diz-se: a) Competente b) Lisogénica c) Infectada d) Incompetente 8- O gene da transposase codifica para uma enzima que: a) Facilita a recombinação homóloga b) Facilita a replicação viral dentro de um genoma c) Facilita a integração em determinados locais de elementos transponíveis d) Facilita a complementação homóloga 9- Os elementos P são transposões de: a) Drosophila melanogaster b) Caenorhabditis elegans c) Escherichia coli d) Drosophila elementi 10) Pequenos fragmentos de DNA que codificam enzimas capazes de cortar esse segmento de DNA e de o introduzir noutro local denominam-se: a) Plasmídeos b) Nucleóides c) Transposões d) DNA topoisomerases

7 7 11) O RNA de interferência é um mecanismo para o silenciamento da expressão de genes ao nível da: a) Replicação b) Transcrição c) Tradução d) Pós-transcrição, mas pré-tradução 12) A proteína que actua como uma endonuclease nos passos iniciais do processamento dos precursores de RNAi denomina-se: a) Phaser b) Sizer c) Dicer d) RNase Respostas Adicionais