Exame de 1ª Época Engenharia Genética 16 de Janeiro de 2009 Duração: 2h30min

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1 Nome: Curso: Nº Exame de 1ª Época Engenharia Genética 16 de Janeiro de 2009 Duração: 2h30min As bactérias Gram-negativas como Salmonella typhi têm de se adaptar a uma variedade de stresses ambientais extremos de temperatura, osmolaridade ou ph para assegurarem a sua sobrevivência. Esta adaptação é efectuada através de vias de transdução de sinal que detectam essas condições ambientais e respondem activando genes cujos produtos vão combater esses mesmos stresses. Um desses sistemas de transdução de sinal que sente perturbações na composição do periplama e membrana externa é composto pelas proteínas CpxA e CpxR. A proteína CpxA é um sensor desses stresses e vai, através de fosforilação, activar a proteína reguladora de resposta CpxR. Este factor de transcrição (CpxR) vai por sua vez regular muitos outros genes por forma a combater o stresse a que as células estão sujeitas. Pretende-se comprovar o envolvimento de CpxR de Salmonella typhi JMDS em resposta ao stresse causado pela expressão da proteína de membrana externa Omp que não é funcional nesta mesma estirpe e se acumula no periplasma, tendo pois de ser eliminada. 1- Suponha que pretende obter um mutante de S. typhi em que o gene cpxr é eliminado do genoma. Se usar o vector de clonagem pk18mobg (canamicina +, mob +, gusa +, lacz + ), descreva a estratégia a utilizar indicando os vários passos até à confirmação do genótipo do mutante obtido. (gusa- β-glucuronidase; lacz- β-galactosidase) (2,0 valores).

2 b) Para testar se a mutação no gene cpxr não tem efeitos de polaridade nos genes a jusante, têm de se fazer estudos de complementação. Descreva, detalhadamente, uma experiência que lhe permita clonar o gene cpxr num vector de expressão e de como o pode introduzir no mutante de eliminação construído na alínea 1a). Suponha que dispõe de todo o material biológico que necessita (1,5 valores). c) Determinaram-se as curvas de crescimento da estirpe S. typhi JMDS e do mutante ΔcpxR, tendo-se verificado que a taxa específica de crescimento para ΔcpxR é inferior à da estirpe S. typhi JMDS. O que pode concluir quanto à importância da proteína CpxR nesta resposta ao stress causado pela acumulação da proteína Omp? (0,5 valores) 2- Como referido anteriormente, CpxR regula a transcrição de muitos outros genes. a) Refira-se a uma abordagem global capaz de identificar quais os genes cuja expressão é alterada por acção de CpxR e refira qual o material biológico, condições experimentais que utilizaria e o princípio teórico desta técnica (2,0 valores)

3 b) Da análise anterior identificaram-se 165 genes possivelmente pertencentes ao regulão Cpx. Suponha que quer futuramente estudar três desses genes e necessita de confirmar por uma segunda via, que eles são de facto regulados por CpxR. Explique como poderia obter esse resultado utilizando fusões lacz (1,5 valores). 3- Dois dos genes regulados por CpxR codificam para as proteínas CpxP com função de chaperona e DegP que é uma protease. Estas duas proteínas interagem entre si e degradam a proteína Omp inactiva. Que método usaria para demonstrar a interacção entre DegP e CpxP? Descreva os vários passos experimentais que teria de efectuar (2,0 valores)

4 4- Suponha que tem um anticorpo policlonal para a proteína Omp obtido por imunização de um coelho. a) Como pode demonstrar in vivo que esta proteína é efectivamente degradada? Refira detalhadamente o procedimento experimental (1,75 valores) b) Se quiser demonstrar que a proteína Omp é degradada por acção de DegP e CpxP in vitro terá de purificar as três proteínas. Refira uma estratégia que lhe permita sobreproduzir em E. coli e purificar estas três proteínas. Descreva também como clona os genes de interesse num vector apropriado para expressão de cada proteína (1,75 valores).

5 5- Foi efectuado um teste de adesão da estirpe S. typhi JMDS e do mutante de eliminação ΔcpxR a superfícies sólidas, tendo-se verificado que o mutante não é capaz de fazer esta adesão. Uma das hipóteses que se coloca é a de estarem ausentes na sua superfície, proteínas da família das adesinas. Se pretender determinar qual a proteína(s) em falta: a) Que estirpes vai usar para comparar proteínas? (0,75 valores) b) Que extratos proteicos vai recolher por forma a minimizar o número de proteínas a analizar? (0,5 valores) c) Como vai separar essas proteínas extraídas e como vai identificar as de interesse? (1,75 valores) 6) Foram registados na unidade de cuidados intensivos de um dado hospital central vários casos de infecções nosocomiais de que resultaram algumas fatalidades. No mesmo hospital, registaram-se também, quase de imediato, 3 casos de septicémia fatal numa outra unidade. Foram recolhidas amostras e as rotinas de identificação e os antibiogramas para os isolados clinicos obtidos permitiram concluir que se tratava da mesma espécie bacteriana: Acinetobacter baumannii multirresistentes. Tendo em conta de que poderia estar perante o surto de uma estirpe altamente infecciosa no hospital, foram adoptadas várias estratégias pela equipa de controlo da infecção hospitalar. a) Proponha 3 metodologias experimentais diferentes que permitam esclarecer se os isolados estudados pertencem a uma ou várias estirpes. (0,5 valores)

6 b)descreva detalhadamente uma delas, indicando as respectivas vantagens e desvantagens relativamente às outras duas técnicas escolhidas em 6a). (1,0 valor). 7-Escolha a opção correcta assinalando com um X (0,5 valores cada): i) Qual dos seguintes passos não está incluído na técnica de Southern blotting? a) Transferência dos fragmentos de DNA para membranas de nylon b) Digestão das amostras de DNA com endonucleases de restrição c) Utilização de sondas radioactivas d) Utilização de uma DNA polimerase estável a 95ºC ii) A designação Shotgun : a) É equivamente à pirosequenciação b) Refere-se a uma técnica onde os cromossomas são fragmentados c) Refere-se a uma técnica para obter cromossomas artificiais d) É equivamente ao termo RFLP iii) A técnica utilizando RNA de interferência envolve: a) A ligação de SiRNA a DNA b) A eliminação de genes c) A tradução de SiRNA para produzir uma proteína repressora d) A ligação de SiRNA a mrna iv) Os transposões "Elemento P" são utilizados na manipulação genética de que espécie? a) Mus musculus (ratinho) b) Drosophila melanogaster (mosca) c) Danio rerio (peixe-zebra) d) Arabidopsis thaliana (erva-estrelada) v) Qual das seguintes técnicas é usada num método de produção de ratinhos transgénicos que envolve a criação de um animal quimérico (constituído por uma mistura de células de diferentes origens?) a) Microinjecção de DNA heterólogo no pronúcleo b) Transfecção de células somáticas com recurso a um vector retroviral c) Transfecção de células estaminais embrionárias d) Transfecção usando como vector o plasmídeo Ti

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