1 º Exame Engenharia Genética 11 de Janeiro de 2013 Duração: 2h30min.

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1 Nome: Curso: Nº 1 º Exame Engenharia Genética 11 de Janeiro de 2013 Duração: 2h30min. A bactéria Edwardsiella tarda causa septicémia hemorrágica em peixes bem como infecções gastrointestinais em humanos. Uma análise sistemática aos seus sistemas reguladores de dois componentes revelou que as proteínas PhoP-PhoQ controlam a expressão de um número elevado de genes que ditam a virulência e a sobrevivência deste microrganismo. Um mutante de eliminação para o gene phop apresenta sensibilidade ao antibiótico clindamicina, ao stresse térmico e a péptidos catiónicos e mostra ainda atenuação da sua virulência em peixe zebra. Dado o envolvimento da proteína PhoP na tolerância ao stresse e na virulência, é necessário identificar os genes/proteínas reguladas por este regulador de transcrição. Tendo em vista este objectivo, os autores deste estudo utilizaram uma abordagem proteómica para estudar o regulão de E. tarda EIB202. Considere que a sequência do genoma desta bactéria é conhecida. 1- A primeira experiência realizada pelos autores foi um estudo de proteómica comparativa. a) Defina proteoma e refira que estirpes usaria nesta experiência. (0,5 valores) b) O resultado desta experiência foi a visualização de 19 spots que apresentaram expressão significativamente diferente. Descreva as etapas principais da abordagem experimental que lhe permitiria obter os resultados mencionados. (1,25 valores)

2 c) Indique três razões possíveis para o número reduzido de proteínas diferencialmente expressas identificadas neste estudo. (0,75 valores) d) Cada spot foi então identificado por espectrometria de massa (MS). Enumere as etapas principais desta experiência. (1,0 valor) 2- A análise dos vários spots por MS resultou na identificação de 18 proteínas diferentes. Para confirmar a expressão diferencial de 10 destas proteínas por uma segunda técnica, os autores recorreram a qrt-pcr. Refira as etapas principais desta experiência até à obtenção dos valores de expressão para cada gene. (2,0 valores)

3 Survival (%) 3- A proteína cujo valor de expressão mais diminuiu foi AtpD, que corresponde à sub-unidade da ATP sintetase F 1 F 0. Para determinar o possível envolvimento desta proteína na virulência de E. tarda, teve de ser construído um mutante de eliminação para o seu gene codificante. a) Refira as etapas principais da construção desse mutante usando um vector não replicativo com as seguintes propriedades: lacz, gusa, mob +, canamicina R. (2,5 valores) b) Uma vez que os autores tinham disponíveis os mutantes atpd e phop e ainda a estirpe selvagem (WT), determinaram a taxa de crescimento de cada estirpe (A) e a de sobrevivência de peixes infectados com cada uma das estirpes (B). Os resultados encontram-se nos gráficos seguintes. Refira as principais conclusões a que se chegou e apresente explicações plausíveis para as diferenças observadas. (1,25 valores) A OD 600nm WT delta phop delta atpd Time (h) B Time (days) WT delta phop delta atpd

4 4- O gene atpd é o oitavo de um operão constituído por 9 genes. Refira como pode demonstrar que estes 9 genes constituem de facto uma estrutura operónica, ou seja que a sua transcrição está dependente de um único promotor a montante do primeiro gene. (1,25 valores) 5- Os autores determinaram ainda se a região promotora do operão atp é um local de ligação para o regulador PhoP. Para tal, necessitaram de obter a região promotora (com aproximadamente 1 kb) e a proteína pura. a) Descreva o processo de clonagem do gene phop num vector apropriado, a sua expressão em E. coli e a purificação da proteína recombinante PhoP-His. (1,5 valores)

5 b) Descreva a técnica que usaria para obter a região promotora, incluindo todo o material biológico necessário. (1,0 valor) c) Para excluir que durante a obtenção da região promotora tenham ocorrido mutações, tem de se sequenciar esse fragmento. Descreva o método que usaria para tal fim. (1,0 valor) d) Descreva a técnica que usaria para demonstrar se efectivamente PhoP-His se liga ao promotor da região atp. (1,0 valor)

6 6- Seleccione a resposta correcta através de um círculo (0,5 valores cada): 1- Uma grelha de leitura aberta (ORF) é: a) a sequência completa de um genoma b) uma sequência usada na preparação de uma biblioteca genómica c) um possível gene identificável na sequência de DNA d) um gene que não tem um fim definido 2- Os passos envolvidos na hibridação de Southern são efectuados na seguinte ordem: 1- transferência por capilaridade; 2-electroforese em gel de agarose; 3-digestão com endonucleases de restrição; 4-fixação por UV; 5-incubação com uma sonda marcada; 6- desnaturação de DNA a) 3,2,4,6,1,5 b) 3,2,6,1,4,5 c) 2,6,1,4,5,3 d) 2,6,3,1,5,3 3- Numa electroforese de campo pulsado os fragmentos de DNA de menor dimensão: a) ficam mais próximos da origem b) originam uma cor mais intensa na presença de compostos fluorescentes c) migram mais rapidamente d) migram mais lentamente 4- A enzima que preenche as extremidades coesivas no DNA denomina-se: a) transcriptase reversa b) telomerase c) Taq DNA polimerase a) fragmento Klenow 5- O RNA em cadeia dupla é usado em engenharia genética como: a) Método para duplicar o nível de expressão dos genes b) Ferramenta experimental que permite silenciar genes de uma forma específica c) Não é usado porque não tem nenhum efeito na expressão genética d) Ferramenta experimental que induz a degradação do DNA 6- Considere a sequência 5 ATGCCTGGACCTTAACGCGCCTAGGTATCTTGA3. Suponha que necessita de iniciadores 11-mer para PCR. Essas sequências serão: a) ATGCCTGGAC e TCAAGATACCT b) TACGGACCTGG e TCAAGATACCT c) ATGCCTGGACC e TCCATAGAACT d) ATGCCTGGACC e TCAAGATACCT 7- A sequenciação de um genoma pela estratégia de pirosequenciação depende de: a) sequenciar rapidamente milhares de pequenos fragmentos clonados aleatoriamente b) sequenciar metodicamente alguns fragmentos de DNA de elevada dimensão c) sequenciar cada cromossoma quando ainda intacto a) sequenciar milhares de pequenos fragmentos não clonados 8- O oligonucleótido iniciador usado na sequenciação automática (termal cycle sequencing) : a) pode apresentar qualquer sequência (random primers) b) deve ter GC no início e no final da sequência c) deve ter uma sequência de nucleótidos igual ao terminal 3 da região a ser copiada d) deve ter uma sequência de nucleótidos complementares ao terminal 3 da região a ser copiada 9- No Sistema de dois híbridos na levedura, a expressão do gene lacz indica que: a) uma proteína teste regula a expressão da outra no híbrido com activação do gene lacz b) uma das proteínas teste e o domínio de activação se ligaram à região UAS c) as duas proteínas teste interagiram uma com a outra d) ambos os genes do híbrido formam um operão que activa a expressão do gene lacz

7 10- O promotor Gal é usado para: a) promover a expressão génica em Saccharomyces cerevisiae b) promover a expressão génica em Escherichia coli c) promover a expressão génica em Pichia pastoris d) promover a expressão génica em mamíferos