Replicação do DNA. Profa. Dra. Aline Maria da Silva Instituto de Química- USP

Transcrição

1 Replicação do DNA Profa. Dra. Aline Maria da Silva Instituto de Química- USP Bibliografia: Genes VII - Benjamin Lewin Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha Lenhinger Principles of Biochemistry (3a. Ed.)

2 Replicação Ácido Desoxirribonucleico Transcrição Ácido Ribonucleico Tradução Proteína

3 Replicação do DNA O mecanismo de replicação está baseado no pareamento das bases da dupla hélice do DNA. A estrutura do DNA contém a informação necessária para perpetuar sua sequência de bases

4 A replicação do DNA é semi-conservativa Cultivo em meio 15 NH 4 Cl Experimento realizado por Meselson & Stahl em 1958 Cultivo em meio 14 NH 4 Cl Purificação do DNA seguida de centrifugação em gradiente de CsCl

5 A replicação é bidirecional

6 A replicação do cromossomo circular

7 Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação Replicon: 1. Origem + Término 2. Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular 3. O genoma de uma célula procariótica constitue um único replicon 4. Cada cromossomo eucariótico constitue vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente

8 A replicação é vista como um olho flanqueado por DNA não replicado

9 O genoma bacteriano circular constitue um único replicon A velocidade da forquillha de replicação bacteriana é 50000pb/min Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)

10 Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação

11 O genoma eucariótico constitue vários replicons A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000pb/min Os replicons eucarióticos tem kb e são iniciados em tempos diferentes Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática

12 Forquilha de replicação: Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas

13 Fita contínua (líder) Fita descontínua

14 Polimerases de DNA: As enzimas que sintetizam DNA A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos a extremidade 3 OH da cadeia em crescimento. O precursor da síntese é o desoxiribonucleosídeo 5 trifosfato Sentido da síntese sempre é 5 3 A replicação é um processo extremamente fiel. As DNApolimerases tem atividade revisora

15 Desoxiribonucleosídeo 5 trifosfato (precursor) Fita sendo polimerizada Fita molde Desoxyribose

16 As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado

17 correto Pareamento de bases incorreto

18 Atividade revisora de exonuclease 3 5 garante a fidelidade da replicação

19 Modelo da estrutura das DNA-polimerases

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21 Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas Pol I PolII PolIII Polimerização Exonuclease Exonuclease Número de subunidades Tamanho em kda ~900 Velocidade de Polimerização(nt/seg) Processividade (nt adicionados antes da dissociação do molde)

22 DNA-polimerase III é uma holoenzima de mais de 10 cadeias de estrutura dimérica

23 A subunidade Beta da DNApolimerase III envolve o duplex das fitas-filhas

24 OriC do cromossomo de E.coli

25 Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coli DnaA DnaB (helicase) DnaC HU Primase (DnaG) Single strand binding (SSB) RNA polimerase DNA girase Dam Metilase Reconhece a origem e abre a dupla fita em sítios específicos Desenrola o DNA Auxilia a ligação de DnaB na origem Proteína do tipo histona que estimula a iniciação Sintetiza os primers de RNA Liga a fita simples de DNA Facilita a ação da DnaA Alivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fita Metila as sequências GATC na OriC

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28 A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA Síntese da Fita descontínua Fita descontínua Fita contínua Síntese da Fita Contínua

29 Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas A DNA ligase sela as quebras

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31 A DNA ligase sela as quebras

32 Mecanismo de ação da DNA ligase

33 Proteínas presentes na forquilha de Replicação de E.coli SSB DnaB (helicase) Primase (DnaG) DNA Polimerase III DNA Polimerase I DNA Ligase DNA girase Liga a fita simples de DNA Desenrola o DNA Sintetiza os primers de RNA Sintese da fita nova Preenche as lacunas e excisa os primers Liga os fragmentos Superenrolamento

34 Síntese das fitas contínua e descontínua é independente

35 O complexo de replicação A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha Cada core catalítico da DNA PolIII sintetiza uma das fitas-filhas O primossomo afasta uma das fitas molde Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas

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37 Forquilha sentido antihorário Forquilha sentido horário Terminação Terminação

38 Duplicação dos cromossomos Separação dos cromossomos e divisão celular