Prof. Dr. Bruno Lazzari de Lima. Replicação do DNA

Transcrição

1 Prof. Dr. Bruno Lazzari de Lima Replicação do DNA

2 Introdução Sistemas vivos tem a capacidade de fazer cópias de si mesmos. Capacidade associada ao material genético hereditário. Compreensão do processo de replicação do DNA.

3 As polimerases do DNA de E. coli (1957). Primeira enzima capaz de polimerizar desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dntps). A síntese requer que os dntps livres sejam adequadamente posicionados sobre a cadeia molde. Mais duas enzimas descobertas. POLIMERASES DO DNA I II e III

4 Os tipos de polimerases do DNA em E. coli. A polimerase III é responsável pelo crescimento das novas cadeias polinucleotídicas durante a replicação do DNA. A polimerase II é uma enzima de reparo. O papel da polimerase I in vivo não é conhecido.

5 A reação de polimerização de cadeias polidesoxirribonucleotídicas. Adição de um dntp por vez na extremidade 3'-OH livre. Sentido 5' 3'. Emparelhamento das bases (da dt ; dc dg). Formação da ligação fosfodiéster 5' 3'.

6 Desoxirribonucleotídeo Replicação do DNA

7 O novo DNA é sintetizado a partir de dntps Na replicação o grupo 3'-OH do último nucleotídeo realiza um ataque nucleofílico sobre o fosfato alpha do dntp incorporado. Uma ligação fosfodiéster forma-se entre os dois nucleotídeos Dois fosfatos são clivados. Um pirofosfato é liberado

8 Pirofosfato (PPi) Durante a síntese de DNA, a formação de um par de bases tem início quando um dntp forma pontes de hidrogênio com um resíduo de nucleotídeo da cadeia molde. O passo seguinte é a formação de ligação fosfodiéster entre o novo nucleotídeo e o resíduo terminal da cadeia em crescimento, com liberação de pirofosfato.

9 O sentido da síntese do DNA. Primeiramente as duas cadeias da molécula devem se separar. A separação ocorre a medida que as duas novas cadeias são sintetizadas. A região de separação das cadeias forma a letra Y e é denominada forquilha de separação.

10 O sentido da síntese do DNA. As duas cadeias filhas são sintetizadas na forquilha de replicação por um complexo de enzimas que inclui a polimerase III do DNA. Cadeias são antiparalelas e a síntese deve ser no sentido 5' 3'. Será que a outra molécula cresce no sentido 3' 5'?

11 O sentido da síntese do DNA. As duas cadeias filhas são sintetizadas na forquilha de replicação por um complexo de enzimas que inclui a polimerase III do DNA. Cadeias são antiparalelas e a síntese deve ser no sentido 5' 3'. Será que a outra molécula cresce no sentido 3' 5'? NÃO

12 NÃO

13 O sentido da síntese do DNA. Uma cadeia é sintetizada no sentido de deslocamento da forquilha. A cadeia de polaridade inversa é sintetizada no sentido inverso de deslocamento da forquilha.

14 O sentido da síntese do DNA. Cadeia que cresce no sentido da forquilha CADEIA LEADING (líder). Cadeia que cresce no sentido oposto da forquilha CADEIA LAGGING (tardia).

15 Sentido de movimento da forquilha de replicação CADEIA LEADING CADEIA LAGGING

16 Reiji Okazaki (1960). Hipótese da síntese semidescontínua. Experimento com bactérias em divisão. Timina tritiada. Somente o DNA recém-sintetizado (imediatamente após as forquilha) torna-se radioativo. Fragmentos radioativos contendo de 1000 a 2000pb. Fragmentos são reunidos formando cadeias longas.

17 Sentido de movimento da forquilha de replicação CADEIA LEADING CADEIA LAGGING Fragmentos de Okazaki

18 Durante a síntese temos a adição de nucleotídeos na extremidade 3'-OH. Assim existe a necessidade da presença de um 3'-OH livre. As polimerases de DNA não conseguem adicionar o primeiro nucleotídeo. Assim, como é iniciada a síntese do DNA?

19 A primase do DNA e a síntese do primer de DNA. Uma enzima especial cataliza a síntese de um pequeno fragmento de RNA sobre a cadeia molde do DNA. Iniciador para a polimerase III do DNA. Primer (iniciador) de RNA. Enzima - Primase do DNA.

20 A primase do DNA e a síntese do primer de DNA. A primase atua no início da replicação. Síntese da cadeia líder. Síntese dos fragmentos de Okazaki. Feitos a intervalos regulares. Termina quando a polimerase de DNA atinge o primer de RNA ligado à extremidade 5' do fragmento sintetizado anteriormente.

21 Sentido de movimento da forquilha de replicação Primer de RNA CADEIA LEADING CADEIA LAGGING Polimerase III de DNA Fragmentos de Okazaki Primase do DNA

22 A substituição do primer por um fragmento de DNA. Cadeia lagging é constituída por fragmentos de Okazaki e primers de RNA. Os primers de RNA devem ser substituídos por DNA. Os fragmentos devem ser unidos.

23 A substituição do primer por um fragmento de DNA. A eliminação dos primers é feita pelas enzimas RNase H e polimerase I do DNA. Rnase H. Degrada moléculas de RNA que formam híbridos com DNA. Polimerase I do DNA. Degrada moléculas de RNA que formam híbridos com DNA. Preenche a falha formada entre os fragmentos de Okazaki.

24 A substituição do primer por um fragmento de DNA. A eliminação dos primers é feita pelas enzimas RNase H e polimerase I do DNA. Rnase H. Degrada moléculas de RNA que formam híbridos com DNA. Polimerase I do DNA. Degrada moléculas de RNA que formam híbridos com DNA. Preenche a falha formada entre os fragmentos de Okazaki.

25 Características da polimerase I do DNA. Cadeia polipeptídica. Polimerização no sentido 5' 3'. Atividade exonucleolítica no sentido 3' 5'. Atividade exonucleolítica no sentido 5' 3'.

26 A reação de deslocamento do corte. Nick translation. Polimerase I reconhece a ausência de ligação fosfodiéster entre a extremidade 3'-OH de um resíduo com a 5' do início do primer de RNA. 5' 3'-OH

27 A reação de deslocamento do corte. Polimerase I liga-se à extremidade 3'-OH e por meio de sua atividade exonucleotídica 5' 3' remove por hidrólise o primeiro nucleotídeo de RNA da extremidade 5'. Por ação de sua atividade polimerizadora adiciona um nucleotídeo de DNA na extremidade 3'-OH. POL I

28 A reação de deslocamento do corte. Polimerase I desloca-se para os próximo nucleotídeo. POL I POL I

29 A reação de deslocamento do corte. Ocorre toda a substituição do primer de RNA por DNA. POL I POL I

30 O Papel da Enzima ligase do DNA. Ao se dissociar do DNA a polimerase I deixa atrás de si uma falha na cadeia lagging. O selamento dessa falha é o último passo no amadurecimento da cadeia lagging e é realizado por uma enzima. Essa enzima catalisa a formação de uma ligação de uma ligação fosfodiéster entre o grupo 3'-OH livre com o grupo 5' dos dois fragmentos de Okazaki vizinhos. Essa reação demanda energia fornecida pela hidrólise de uma molécula de ATP.

31 LIGASE ATP ADP

32 Forquilha de replicação Para que ocorra a replicação semiconservativa a hélice de DNA deve ser aberta. O desenrolamento da hélice de DNA e a separação das cadeias polinucleotídicas é catalisado por enzimas. Proteína Rep. Se move sobre o molde da cadeia leading. Proteína DnaB. Se move sobre o molde da cadeia lagging. Esse processo depende do consumo de ATP.

33 Ação das Helicases. Replicação do DNA

34 Proteínas que impedem a renaturação do DNA. Duas cadeias complementares tendem a se renaturarem. As cadeias mantêm-se separadas na região da forquilha graças a ação de proteínas especiais denominadas SSB (Single Strand DNA-Binding proteínas ligantes a DNA de hélice simples). Impedem a formação de hairpins. Essas proteínas não cobrem as bases. As proteínas SSB atuam cooperativamente e mantem as cadeias simples de DNA estendidas facilitando a ação da polimerase III do DNA.

35 Ação as SSB. Replicação do DNA

36 O Relaxamento da hélice pela topoisomerase. A separação de duas cadeias provoca o super enrolamento da hélice na região imediatamente à frente da forquilha de replicação. A medida que a forquilha se move, todo o cromossomo ou plasmídeo sofre superenrolamento. Isso impediria a continuidade do processo. TOPOISOMERASE II

37 Ação da topoisomerase II.

38 O Replissomo. A maioria da proteínas que atuam na replicação do DNA formam um grande complexo denominado replissomo. Esse é formado por duas POL-III, associadas a um subcompleso chamado primossomo. Uma POL-III da cadeia líder. Uma POL-III da cadeia tardia.

39 O Replissomo. Polimerase III. Capacidade de processar continuamente grandes sequências de DNA, até encontrar um bloqueio. Diferente de outras polimerases de DNA. Associação com uma proteína que forma um anel ao redor da cadeia molde. O anel solta-se somente quando a polimerase para de agir.

40 O Replissomo. Polimerase III. +

41 O Replissomo. O Primossomo. É constituído: Primase do DNA. 6 helicases DnaB. Move-se imediatamente atrás da forquilha de replicação. A primese produz os primers de RNA. A polimerase III alonga o primer em um fragmento de Okazaki.

42 O Replissomo. Replicação do DNA

43 O Replissomo. A proteínas responsáveis pela síntese da cadeia lagging se mantém na forquilha de replicação associadas às proteínas responsáveis pela síntese da cadeia leading. Assim a cadeia molde da cadeia lagging faz uma dobra para trás.

44 O Replissomo. Replicação do DNA

45 O Replissomo. Quando a Polimerase III encontra um primer de RNA de um fragmento de Okazaki, ela solta a cadeia molde e move-se no sentido da forquilha de replicação, até encontrar um novo primer de RNA.

46 O Replissomo. VÍDEO

47 O Replissomo. A POL-III que sintetiza a cadeia líder possui alta velocidade, nunca se soltando da cadeia molde. A POL-III da cadeia tardia solta-se da molde sempre que encontra a extremidade 3'-OH de um primer de RNA. Evidências demonstram que essas POL-III são ligeiramente diferentes em suas estuturas.

48 A origem da replicação em bactérias. A replicação do cromossomo da bactéria E. coli, o qual é uma molécula circular, tem início em um único sítio denominado oridem de replicação ou oric. O oric consiste de no mínimo 245 nucleotídeos. Dois terços dessa sequência encontra-se na oric de outras cinco espécies de bactérias. Devem interagir com proteínas de replicação igualmente conservadas. DnaA.

49 A origem da replicação em bactérias. As moléculas de DnaA se ligam cooperativamente ao DNA. A molécula de DNA abre-se ligeiramente. Isso permite a entrada de DnaB e DnaC (helicases). Liberação das DnaA. Manutenção da separação pelas SSB. Formação de dois replissomos que se movem em sentidos opostos. Região que se replica = REPLICON. REPLICAÇÃO BIDIRECIONAL

50 A origem da replicação em bactérias.

51 Replicação do DNA em eucariontes. É fundamentalmente semelhante ao observado em procariontes. A replicação em eucariontes é mais lenta. O DNA eucarionte encontra-se mais empacotado (nucleossomos), o que dificulta a replicação. Fragmentos de Okazaki mais curtos.

52 Replicação do DNA em eucariontes. Origens múltiplas de replicação (múltiplos replicons). A replicação inicia-se em vários sítios. Bactérias possuem o oric. Em Drosophilas o cromossomo maior pode apresentar mais de 6 mil origens. Isso diminui o tempo de replicação do genoma eucarionte. Replicação bidirecional.

53 Replicação do DNA em eucariontes. Sequências de replicação somente foram identificadas em leveduras e em vírus de mamíferos.

54 Exercícios Porque a replicação do DNA é semiquantitativa? Porque a replicação do DNA é semidescontínua? O que são fragmentos de Okazaki? O que é um replissomo? O que é um primossomo? Explique sucintamente o processo de replicação do DNA, incluíndo os nomes das enzimas envolvidas, bem como suas funções. Explique porque existe a necessidade de um primer de RNA para a ação da polimerase de DNA. Explique sucintamente o papel da helicase, da topoisomerase II e das SSB na replicação do DNA.