Biologia Molecular. O que é Biologia Molecular? Aplicabilidades da Biologia Molecular 3/12/2017. IFSC Campus Lages. Prof.

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1 IFSC Campus Lages Biologia Molecular Prof. Silmar Primieri O que é Biologia Molecular? Aplicabilidades da Biologia Molecular Genética do Câncer Doenças com herança complexa Preservação de espécies ameaçadas de extinção Taxonomia molecular Diagnóstico pré-implantacional de embriões Aconselhamento genético Genética Forense Controle biológico Transgênicos 1

2 Descoberta do DNA 1860 Miescher isolou uma substância nova de dentro das células, chamada nucleína Em 1881, Albrecht identificou a nucleina como um ácido nucleico. Ele também isolou os cinco nucleotídeos. adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) e uracilo (U). Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em O trabalho de Gregor Mendel foi redescoberto 1909 Levine e Jacobs determinaram a organização das moléculas que compõem o ácido nucléico Descoberta do DNA Estrutura helicoidal do DNA Na década de 40 os biofísicos utilizaram difração de raios X para determinar a estrutura do DNA. DNA como material hereditário Experiência de Avery-Macleod-McCarty ---- Frederick Griffith 2

3 Experiência de Avery-Macleod-McCarty ---- Frederick Griffith DNA DNA DNA ácido desoxirribonucléico. O DNA é o material genético dos organismos vivos e muitos vírus (alguns vírus utilizam o RNA como material genético). O DNA é uma molécula simples que consiste de uma cadeia polinucleotídica na forma de dupla hélice. 3

4 Fosfato Do que é formado o DNA? Nucleotídeos Base Nitrogenada Bases púricas Adenina Guanina Bases pirimídicas Citosina Timina Uracila Desoxirribose PENTOSES Nucleotídeos 4

5 Como os nucleotídeos de ligam entre si? Ligação fosfodiéster Ocorre entre o fosfato do carbono 5 da pentose de um nucleotídeo e a hidroxila do carbono 3 da pentose do nucleotídeo seguinte 5

6 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS - NUCLEOTÍDEOS Cinco tipos: Adenina, Guanina, Citosina, Timina e Uracila. Adenina e Guanina: Duplo anel de átomos de carbono (anéis aromáticos); chamadas de purinas ou bases púricas. Citosina, Timina e Uracila: Um anel de carbono; chamadas pirimidinas ou bases pirimídicas. DNA: Adenina Timina; Citosina Guanina RNA: Adenina Uracila; Citosina - Guanina DUPLA HÉLICE DO DNA Duas fitas se enrolam em torno de um eixo imaginário; Desoxirriboses ficam externas (expostas ao meio aquoso) e bases ficam internas (anéis são hidrofóbicos); Fitas em direções opostas: 5-3 e 3-5 = FITAS ANTIPARALELAS; As bases ficam pareadas entre as duas fitas, mantendo a estrutura da molécula. O DNA É UMA DUPLA HÉLICE Em 1953 Watson & Crick demonstram que o DNA é uma dupla hélice, com as cadeias de DNA em orientação antiparalela, com as bases emparelhadas: 6

7 LIGAÇÃO ENTRE BASES NITROGENADAS A ligação feita por pontes de hidrogênio: Timina (T) liga-se à Adenina (A) - duas pontes de hidrogênio; Citosina (C) liga-se à Guanina (G) - três pontes de hidrogênio. LIGAÇÃO ENTRE BASES NITROGENADAS Tais pontes de hidrogênio são formadas em decorrência da presença de grupos ceto (C=O) e amino (C-NH 2 ) nas bases; T e U ceto A amino G grupo ceto e amino C grupo ceto e amino Pareamento entre as fitas de DNA Na molécula de DNA o pareamento das fitas é antiparalelo (esquema ao lado) 3' 5' / 5' 3' 7

8 Pontes de hidrogênio Questão Se uma sequência de uma fita de polinucleotídeos fosse AATCCATGT, qual seria o filamento complementar? DESNATURAÇÃO E RENATURAÇÃO São processos importantíssimos para a replicação, recombinação e transcrição do material genético; Desnaturação: pontes de hidrogênio entre as fitas complementares são rompidas; Renaturação: inverso da desnaturação. 8

9 DESNATURAÇÃO Pode ocorrer por aumento de temperatura, tratamento com ácidos ou bases, agentes desnaturantes e concentração de sal; Pareamento entre as bases não apresenta a mesma estabilidade separação de GC exige temperaturas mais altas, ou concentração de agentes desnaturantes, devido à diferenças do número de pontes de hidrogênio. DESNATURAÇÃO Tm: Temperatura na qual 50% do DNA encontrase desnaturado; A Tm depende da proporção de bases AT em relação à GC; [ ] GC Temperatura Tm RENATURAÇÃO Ocorre através do resfriamento; O anelamento ocorre a uma temperatura de 25ºC abaixo da Tm; À medida que algumas bases se associam, a velocidade de renaturação aumenta; Caso ocorra um resfriamento abrupto, as fitas de DNA podem colapsar e não renaturar. 9

10 RENATURAÇÃO A velocidade de renaturação do genoma depende do seu tamanho e da sua complexidade Sintético TIPOS DE DNA Oligonucleotídeos: sequências curtas e prédeterminadas de DNA sintético; Fisiológicos (in vivo) Tipo B, A e Z: Diferem quanto à conformação e podem facilitar ou dificultar a interação da molécula com proteínas. ESTRUTURA DO RNA Polímero linear de nucleotídeos unidos por ligações fosfodiéster 5 3 ; Ribose - açúcar presente; Timina (T) é substituída pela Uracila (U); Normalmente fita simples, embora possa apresentar pareamento intracadeia (estrutura similar ao DNA tipo A); Alguns vírus apresentam RNA fita dupla como genoma; 10

11 TIPO DE RNA: LOCALIZAÇÃO E FUNÇÃO mrna (mensageiro): transfere a informação do DNA ao ribossomo para a síntese de proteínas; rrna (ribossomal): componente dos ribossomos Representa 75% do RNA total da célula; trna (transportador): carrega os resíduos de aminoácidos até os ribossomos para a síntese de proteínas. mrna Replicação do DNA Todos os organismos devem duplicar o seu DNA com extrema precisão antes de cada divisão celular; Mecanismos básicos de replicação: Separação das cadeias de DNA Cópia de cada cadeia que serve como molde Síntese da nova cadeia complementar 11

12 Replicação do DNA A replicação ou duplicação do DNA representa a transmissão fiel da informação hereditária Tipos de replicação 8.13 Forquilha de Replicação Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas 12

13 Replicon Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação Origem + Término Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular O genoma de uma célula procariótica possui um único replicon Cada cromossomo eucariótico possui vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente Existem origens de replicação Se a replicação começasse por um extremo da molécula de DNA e terminasse em outro, estima-se que seria necessário 1 mês para o cromossomo humano se replicar; No genoma procarioto existem uma origem de replicação; já em células eucariontes existem múltiplas origens de replicação. Em um cromossomo médio existem, pelo menos 200 origens de replicação; Unidades de replicação (replicons): início da replicação em várias origens ao longo do genoma. Replicação é bidirecional Uma vez iniciada a replicação em cada ponto da origem ela se propaga para os dois lados da molécula de DNA até encontrar replicons vizinhos Replicação bidirecional envolve duas forquilhas de replicação que se locomovem em direções opostas. 13

14 Replicon em célula procariótica A velocidade da forquilha de replicação bacteriana é pb/min Um única origem de replicação em E.coli Replicon em genoma eucarioto A velocidade da forquilha de replicação eucariótica é pb/min Fase S do ciclo celular demora ~ 6hrs em uma célula somática Replicação é semidescontínua A polimerização dos desoxirribonucleotídeos na síntese do DNA acontece somente na direção 5 3 ; Porém, as duas fitas são antiparalelas... logo, como ambas as fitas podem ser sintetizadas simultaneamente??? A cópia da cadeia parental 3 5 pode ser sintetizada continuamente. Essa cadeia filha que avança na direção 5 3 recebe o nome de cadeia líder ou cadeia contínua; A cadeia parental 5 3 deve ser copiada de forma descontínua, a qual recebe o nome de cadeia retardatária, ou cadeia descontínua. 14

15 Replicação é semidescontínua Os fragmentos da cadeia descontínua recebem o nome de fragmentos de Okazaki; São cadeias curtas: Procariontes: pb; Eucariontes: pb. Origens de replicação Locais com sequência específica fácil de separar Ligam proteínas iniciadoras Quando acionadas, essas proteínas permitem o início da replicação Origens de replicação Tendem a ser ativadas em grupo, formando unidades de replicação. 15

16 Micrografia, bolha de replicação Forquilhas de replicação Primase Sintetiza um primer de RNA contendo aproximadamente 11 bases; DNA-polimerase adiciona os nucleotídeos iniciais na origem de replicação dos pequenos fragmentos de Okazaki; 16

17 Replicação das fitas Fita líder Primase age uma vez Fita retardada Primase age várias vezes Fragmentos de Okasaki Direções de replicação na Forquilha TOPOISOMERASES Enzimas que promovem a quebra de ligações fosfodiéster; As fitas de DNA podem, assim, passarem uma sobre a outra e alterarem o superenrolamento da molécula; São importantes nos eventos de replicação, transcrição e recombinação; Enzimas alvos de drogas antimicrobianas e anticancerígenas. 17

18 DNA polimerase Enzimas que catalisam a reação de síntese do DNA. Adiciona nucleotídeos trifosfato à extremidades 3 OH livre. Alongamento da cadeia de DNA sempre é feito na direção 5-3. Incapaz de fazer DNA do zero (precisa ter extremidade 3 OH livre). Possui mecanismo de correção de erros (exonuclease 3-5 ) DNA-polimerases - Procariotos Tipo DNA Polimerase I Função Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5 3 ; Atividade de exonuclease 3 5 Remove o primer de RNA da fita descontínua. DNA Polimerase II Polimerase alternativa de reparo. DNA Polimerase III Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5 3. É a polimerase primária durante a replicação normal do DNA DNA-polimerases - Eucariotos Tipo DNA Polimerase α (alfa) DNA Polimerase δ (delta) DNA Polimerase ε (épsilon) DNA Polimerase β (beta) DNA Polimerase γ (gama) Função Replicação do cromossomo nuclear (fita descontínua) Replicação do filamento contínuo do cromossomo nuclear Reparo do DNA do cromossomo nuclear É pequena e atua no reparo de DNA Replicação de DNA mitocondrial 18

19 Forquilha de replicação Polaridade da síntese define fitas líder e retardada (descontínua) A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA 19

20 Síntese da Fita descontínua Fita descontínua Fita contínua Síntese da Fita Contínua A DNA ligase une os pedaços quebrados de DNA, catalisando a formação de uma ligação fosfodiéster entre a extremidade 5 com a 3 adjacente. Reparo pela Polimerase Mecanismo de verificação (Proof-reading) DNA-polimerase possui Uma atividade de polimerização 5 3 Uma atividade de exonuclease 3 5 DNA Repair Checagem de pareamento incorreto (eucariotos) Proteínas especiais para reparo do erro 20

21 Doenças causadas por problemas no mecanismos de replicação Ataxia de Friedreich's dano progressivo no sistema nervoso (problemas musculares, na fala e doenças no coração) forma mais comum das ataxias herdadas A seqüência GAATTC se repete, quando existem mais de 40 repetições, o indivíduo apresenta a doença. Xeroderma pigmentosum envelhecimento precoce aumento na incidência de câncer Falha no mecanismo de reparação do DNA causado pela luz UV 21

22 Síndrome de Werner Doenças causadas por problemas no mecanismos de replicação Envelhecimento precoce, incluindo rugas, cataratas, osteoporose, cabelos grisalhos e doenças cardiovasculares. Telômeros mais curtos. Conclusões Replicação semi-conservativa Bolha de replicação avança em duas direções Fita líder e fita retardada Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA Primase faz o primer DNA polimerase III, DNA polimerase I DNA ligase Telomerase 22