do DNA A manutenção da acentuada organização celular depende de duplicação fiel da informação genética armazenada no DNA replicação do DNA

Transcrição

1 Replicação e Reparação do DNA BCM I T.03 A manutenção da acentuada organização celular depende de duplicação fiel da informação genética armazenada no DNA replicação do DNA vigilância contínua e reparação da informação danificada por compostos químicos e radiações (do exterior) acidentes térmicos e moléculas reactivas (do interior) reparação do DNA A sobrevivência imediata do organismo requer estabilidade depende da capacidade das células evitarem alterações do seu DNA A sobrevivência a prazo duma espécie necessita variação depende do sucesso de algumas das alterações sofridas pelas sequências de DNA ao longo de várias gerações

2 As sequências de DNA são mantidas e replicadas com alta fidelidade as maquinarias proteicas responsáveis catalisam alguns dos mais rápidos e precisos processos que ocorrem na célula e demonstram a elegância e eficiência da química celular Ocasionalmente os processos de manutenção do DNA falham pode ocorrer alteração permanente da sequência do DNA mutação A mutação pode alterar a sequência de aminoácidos (função) duma proteína se prejudicial - selecção negativa conduz à eliminação da célula ou organismo se favorável - selecção positiva promove a sobrevivência do organismo evolução (tentativa e erro)

3 A taxa de mutação é reduzida idêntica em todos os organismos ±1 nucleótido/ 10 9 nucleótidos / replicação no homem (± 3 x 10 9 pares de nucleótidos) são alterados 3 nucleótidos/divisão celular constante e cumulativa ao longo do tempo taxa de evolução característica para uma proteína (ou grupo) variável entre proteínas A baixa taxa de mutação assegura uma transmissão genética precisa entre gerações manutenção da espécie evita alterações nas células somáticas manutenção do indivíduo evita o aparecimento de células variantes que tendam a proliferar descontroladamente à custa do resto do organismo (cancro)

4 Os organismos duplicam (replicam) o seu DNA com precisão antes de cada divisão celular A replicação assenta no emparelhamento das bases a sequência de nucleótidos de uma cadeia é copiada numa sequência complementar cada nucleotídeo da cadeia-molde tem de ser reconhecido por um nucleotídeo livre complementar as 2 cadeias constituintes da molécula do DNA têm de estar separadas exposição dos grupos dador e aceitador das pontes de H em cada uma das bases para que possa ocorrer o emparelhamento é semi-conservativa as cadeias originais funcionam de molde cada nova molécula inclui apenas uma cadeia nova

5 A polimerização ordenada dos presursores de DNA é sequencial formação de sucessivas ligações fosfodiester ataque nucleofílico do resíduo 5 P ao grupo OH em posição 3 da pentose do nucleótido precedente é unidireccional apenas na direcção 5 P 3 OH é catalizada pela DNA polimerase

6 A replicação das 2 cadeias do DNA apresenta-se segundo uma estrutura em Y forquilha de replicação mas não é simultânea (é assimétrica) uma cadeia (3 5 ) é favorável àelongação da nova cadeia (5 3 ) há polimerização sequencial dos nucleótidos cadeia líder (contínua) a complementar (5 3 ) não é favorável à elongação da nova cadeia (5 3 ) a polimerização só é possível após a libertação do molde (no curso da cópia da cadeia líder) cadeia retardada (descontínua) fragmentos de Okazaki

7 A DNA polimerase não é capaz de iniciar uma nova cadeia de DNA juntando 2 nucleotídeos necessita duma extremidade 3 OH emparelhada sequência iniciadora (primer) A fidelidade da replicação é assegurada durante a polimerização o nucleotídeo correcto tem maior afinidade pela polimerase em movimento o nucleotídeo incorrecto tende a dissociar-se durante a alteração conformacional da polimerase a polimerase verifica o emparelhamento antes da adição de novo nucleotídeo por (auto) correcção exonucleásica 3-5 a polimerase edita qualquer nucleotídeo mal emparelhado na extremidade iniciadora

8 por reparação do emparelhamento remove erros que escapam à exonuclease de correcção mas não por reconhecimento de mau emparelhamento dos nucleótidos detecta a distorção da hélice de DNA resultante de interacções erradas assim assegura a correcção de erros na cadeia recém-sintetisada a acção cumulativa dos 2 mecanismos autocorrectores e do reparador aumentam o grau de fidelidade do processo de replicação

9 O início da polimerização duma nova cadeia uma sequência iniciadora para a DNA polimerase é catalisada pela DNA primase sintetiza primers de RNA (±10 ribonucleótideos) na cadeia líder 1 vez na cadeia descontínua a cada nucleótidos de intervalo a DNA polimerase continua a polimerização substitui o primer a DNA ligase termina a cadeia

10 A dupla hélice de DNA é mantida separada por proteínas especiais a DNA helicase provove o desenrolamento do DNA as SSB - proteínas ligadoras de DNA de cadeia simples (desestabilizadoras de hélices) ligam-se cooperativamente às cadeias simples estabilizando-as

11 A DNA polimerase é mantida ligada ao DNA por uma cinta deslizante A cooperação das proteínas na forquilha de replicação assegura a eficácia da maquinaria de replicação

12 O avanço da forquilha de replicação gera o problema do enrolamento cada 10 pares de bases uma volta da hélice As DNA topoisomerases evitam o emaranhamento formam uma ligação covalente reversível com um fosfato por quebra duma ligação fosfodiéster na cadeia de DNA a topoisomerase I produz uma clivagem temporária numa cadeia permite a rotação da dupla hélice usando a ligação fosfodiéster oposta à clivagem

13 A topoisomerase II forma uma ligação covalente simultâneamente com ambas as cadeias de DNA quebra temporariamente a dupla hélice permite a separação de dois cromossomas entrelaçados clivagem reversível da dupla hélice passagem da 2ª hélice pela abertura restabelecimento da ligação do DNA

14 O início da replicação do DNA envolve reconhecimento de cada de origem da replicação pelos elementos intervenientes no processo desnaturação localizada do DNA afastamento das duas cadeias estabilização de cada uma das cadeias simples, ao nível da origem permite o início da polimerização As proteínas iniciadoras reconhecem as regiões de origem sequências de ±11 pares de bases ARS (autonomous replicating seq.) rodeadas por segmentos de A-T o par A-T (2 pontes de H) dá maior fragilidade ao DNA

15 O processo de replicação é semelhante em pro e eucariotas o cromossoma bacteriano tem apenas uma origem de replicação as 2 forquilhas seguem em direcções opostas até se encontrarem os cromossomas eucariotas contêm multiplas origens de replicação as forquilhas são formadas em pares, seguindo até encontrar outra ou atingir o fim do cromossoma

16 A sobrevivência do indivíduo requer estabilidade genética um mecanismo preciso para replicar o DNA mecanismos de reparação das lesões acidentais quotidianas no DNA menos de 1/1000 alterações/dia resultam numa mutação permanente parte importante das proteínas celulares são reparadoras do DNA falhas nessas proteínas aumento da taxa de mutação doença

17 Apesar de bastante estável o DNA é uma molécula complexa susceptível a alterações mutantes expontâneas danificável por oxidação hidrólise metilação metabolitos reactivos (incluindo oxigénio) produtos químicos ambientais radiação UV (solar ou não) produção de ligação covalente entre pirimidinas adjacentes (T-T, T-C, C-C)

18 sensível a flutuações térmicas causadoras de hidrólise depurinação ±5000 bases púricas (A, G) / célula / dia desaminação ±100 C U / célula / dia a não correcção destas alterações tende a conduzir a delecção de 1 pb substituição de 1 pb de uma das cadeias-filha do DNA a mutação passa à descendência

19 A estrutura do DNA favorece a reparação duas cópias separadas da informação (uma em cada cadeia) quando uma cadeia é danificada a complementar retém 1 cópia intacta esta cópia pode ser usada para restaurar a sequência correcta Independentemente do sistema enzimas de reparação próprias preferências quanto ao tipo de lesão a maioria usa a cadeia não danificada como molde para corrigir a danificada Há 2 vias principais de reparação reparação por excisão de bases DNA glicosilases (6 tipos) + AP endonuclease

20 as lesões por depurinação (remoção de uma base) são directamente corrigidas pela AP endonuclease reparação por excisão de nucleótidos pode corrigir qualquer alteração ± volumosa da estrutura do DNA um complexo multienzimático procura distorções da hélice uma nuclease cliva a ligação fosfodiéster da cadeia (dos 2 lados da alteração) a DNA helicase retira o oligonucleótido a DNA polimerase e a DNA ligase reparam a cadeia

21 As quebras da cadeia dupla também são corrigidas normalmente causadas por radiações ionizantes, agentes oxidantes, alguns produtos metabólicos não havendo uma cadeia molde intacta para a reparação junção de extremidades não homólogas (solução de emergência) junção de extremidades homólogas (recombinação homóloga) cromossoma não lesado como molde As células podem produzir enzimas de reparação em resposta a lesões e.g., resposta ao choque térmico