Lição nº1. 17 (T1) e 18 (T2) de Setembro

Transcrição

1 GENÉTICA e BIOLOGIA MOLECULAR (componente Biologia Molecular) DBV- Secção de Genética e Dinâmica de Populações Faculdade de Ciências de Lisboa Ano lectivo de 07/08 SUMÁRIOS Lição nº1 17 (T1) e 18 (T2) de Setembro embro 2007 Dogma central: replicação do DNA, transcrição e tradução. Expressão génica. Actualização dos conceitos do Dogma Central. As moléculas da Biologia Molecular. DNA, RNA e proteínas. Lição nº2 20 (T1) e 19 (T2) de Setembro 2007 A composição molecular do DNA. Estrutura tridimensional do DNA. Diferentes conformações do DNA. Relação estrutura vs função do DNA. Molécula de DNA dinâmica. Estrutra vs função das moléculas de RNA. Estrutra das proteínas, domínios e motivos proteicos. Proteínas de ligação ao DNA, interacção entre proteínas, recrutamento de proteínas. Lição nº3 24 (T1) e 21 (T2) de Setembro 2007 Manipulação dos ácidos nucleicos. Propriedades físico-químicas da molécula de DNA importantes na sua manipulação. Medição da concentração dos ácidos nucleicos em solução. Desnaturação e renaturação dos ácidos nucleicos. Factores que afectam a velocidade de desnaturação e renaturação do DNA. Noção de temperatura de fusão (Tm), factores que afectam este parâmetro. Como se visualiza o DNA. Lição nº4 25 (T1) e 25 (T2) de Setembro 2007 Replicação do DNA. Mecanismo geral de replicação (semi-conservativo). Replicação do DNA em procariotas. Etapas da replicação: iniciação, alongamento e terminação. Síntese da cadeia líder e da cadeia atrasada. Origem de replicação, formação da bolha de replicação e do garfo de replicação, síntese do primer de RNA, síntese dos fragmentos de Okazaki. Enzimas envolvidas no processo de replicação em procariotas. Função e características das DNA polimerases I, II e III. Função da helicase, SSB e primases. Manipulação topológica do DNA: classificação e modo de acção das diferentes topoisomerases. Características das DNA polimerases usadas na tecnologia de DNA recombinante. Lição nº5 27 (T1) e 26 (T2) de Setembro 2007 Definição de replicão. Diferentes modelos de replicação do DNA: modelo teta, modelo do círculo rolante e replicação de moléculas de DNA lineares. Terminação da replicação em E. coli e em eucariotas. Replicação em eucariotas. As DNA polimerases de células eucariotas. Origem de replicação, alongamento e terminação da replicação em eucariotas. Replicação dos telómeros. Replication slippage. Lição nº6 1 Outubro (T1) e 28 (T2) de Setembro 2007 Técnica de PCR. Diferentes passos e suas características. Condições de uma reacção de PCR. Escolha dos primers. Aplicação do PCR no estudo de polimorfismos genéticos. Lição nº7 2 Outubro (T1 e T2) 2007

2 Técnica de sequenciação do DNA pelo método dos terminadores de cadeia ou técnica de Sanger. Diferentes etapas desta técnica. DNA polimerases, características dos didesoxirribonucleótidos, primers universais. Utilização de software na análise e tratamento das sequências nucleotídicas. Lição nº8 4 (T1) ) e 3 Outubro (T2) 2007 Sistemas de modificação/restrição em bactérias. Metilação do DNA em procariotas. Metilação do DNA em eucariotas como factor condicionante da expressão génica. Propriedades dos sistemas de metilação/restrição de tipo I, II, III. Sistemas de restrição: mcra, mcrbc, mrr. Sistemas de metilação dam e dcm. Características das enzimas de restrição de tipo II. Lição nº9 8 (T1) e 9 (T2) Outubro 2007 Enzimas isoesquisoméricas. Diferentes tipos de isoesquisómeros. Diferentes enzimas de restrição que geram extremidades compatíveis. Enzimas de restrição com diferentes sensibilidades à metilação. Utilização de diferentes enzimas de restrição, consoante o sistema de metilação dos hospedeiros. Alteração da especificidade de clivagem devido à metilação. Clonagem molecular. Acontecimentos básicos numa experiência de clonagem. Construção de uma molécula de DNA recombinante. A clonagem permite a purificação de fragmentos individuais de DNA. Características do DNA plasmídico: origem de replicação plasmídica, controlo do número de cópias, marca de selecção. Plasmídios naturais e plasmídios recombinantes. A metilação na clonagem molecular. Características e escolha dos hospedeiros. Construção de bibliotecas genómicas e de cdna. Síntese de cdna. Lição nº10 9 (T1) e 10 (T2) Outubro 2007 Genoma. Diferenças entre organismos procariotas e eucariotas. Principais características dos genomas dos organismos procariotas e eucariotas; vários exemplos. Paradoxo-C. Superenrolamento do DNA. Enrolamento positivo e negativo do DNA. Modo de acção das topoisomerases. O cromossoma nas células procarióticas: constituição, estrutura e características. Estrutura do cromossoma de Escherichia coli. Estrutura do cromossoma eucariótico. Arranjo das fibras de cromatina: diferentes níveis de condensação da molécula de DNA. Estrutura do centrómero e do telómero. Anatomia do genoma eucariótico. Organização e estrutura dos genes no genoma procariótico. Organização dos genes nos genomas eucarióticos. Lição nº11 11 (T1) e 12 (T2) Outubro 2007 Genes de cópia única e DNA repetitivo. Repetições dispersas: LINES e SINES, retrotransposões e transposões de DNA. Repetições agrupadas: microsatélites e minisatélites. Famílias multigénicas simples e complexas. Famílias dispersas e agrupadas. Mutagénese. O que é uma mutação. Diferentes classificações de mutações. Origem das mutações: mutações espontâneas e mutações induzidas. Efeito das mutações nas células somáticas, da linha germinal e em microrganismos. Organismos auxotrofos. Expresssão condicional e não-condicional das mutações. Mutantes letais condicionais (exemplo de organismos termo-sensíveis), mutantes constituitivos (exemplo de mutaçoes no operão lac). Efeitos das mutações na função dos genes: mutações hipomórficas, hipermórficas e de ganho de função. Substituição de nucleótidos.

3 Transições e transversões. Bases tautoméricas. Efeito das mutações na tradução. Mutações silenciosas ou sinónimas, missense, nonsense e frameshift. Mutações em regiões codificantes e não codificantes. Lição nº12 15 (T1) e 16 (T2) Outubro 2007 Metilação das citosinas. Desaminação da citosina e da 5-metilcitosina. Principais agentes de mutagénese e o seu mecanismo de acção. Análogos de base e de nucleótidos. Agentes químicos (agentes oxidantes, agentes alquilantes e agentes intercalantes). Agentes físicos: radiação ultravioleta e radiação ionizante. Exemplo de mutagénese in vitro usando bisulfito de sódio. Mutagénese dirigida: diferentes estratégias de mutagénese dirigida por um oligonucleótido. Sistemas de reparação do DNA. Tipo de lesões que requerem reparações. Sistemas de reparação directos (ex: fotoreparação dos dímeros de timina). Sistemas de reparação por excisão: endonucleases AP, glicosilases e sistema MutHLS. Sistemas de reparação por excisão de nucleótiodos: sistema UvrABC. Sistemas de reparação dd clivagem de moléculas de DNA em cadeia dupla. Reversão de mutações e mutações supressoras. Sistema SOS. Lição nº13 16 (T1) e 17 (T2) Outubro 2007 Expressão génica. Transcrição em procariotas. Diferenças entre transcrição e replicação. Características e estrutura da RNA polimerase; função das suas diferentes sub-unidades. Etapas da transcrição. Iniciação, alongamento e terminação. Promotores bacterianos e sequências consensus. Sequências codificantes e não codificantes. Sequências 5 líder e 3 trailler. Sentido da transcrição. Terminadores Rho-dependentes e Rho-independentes. Regulação da transcrição. Diferentes factores sigma na regulação da transcrição em procariotas. Lição nº14 18 (T1) e 23 (T2) Outubro 2007 Sistema de regulação em procariotas. Controlo positivo e negativo. Sistemas repressíveis e induzíveis. Repressão e indução de síntese de enzimas. O operão lac como paradigma da regulação positiva e negativa. Constituição génica do operão lac e características dos seus produtos. Indução da expressão dos genes do operão lac. Repressão catabólica como mecanismo de regulação positiva dos genes do operão lac. Crescimento diáuxico. Característica dos mutantes do operão lac: I -, i s, laci q, o c, e consequências fenotípicas. Experiências de complementação no operão lac de E. coli. Resumo dos elementos de regulação da expressão génica do operão lac. Lição nº15 22 (T1) e 24 (T2) Outubro 2007 Transcrição em eucariotas. Acontecimentos importantes para que se inicie a transcrição. Remodelação da cromatina: alterações locais da esturura da cromatina por acção das acetilases de histonas (HATs) e complexos remodeladores da cromatina (CRC). Metilação do DNA e bloqueio da transcrição de genes de eucariotas. Diferenças principais em relação à transcrição em procariotas. Características principais das RNA polimerases dos eucariotas. Transcrição dos genes dependentes da RNA polimerase II. Características da regiões promotoras principais ( core ) dos eucariotas: TATA, InR, BRE, DPE. Controlo do início da transcrição em eucariotas. Factores gerais de transcrição. Função de TFIID e TFIIH. Formação do complexo de préiniciação. Diferentes activadores e repressores do início da transcrição. Proteínas mediadoras da

4 transcrição. Elementos de resposta. Estrutura modular das regiões activadoras/promotoras dos genes eucariotas. Lição nº16 23 (T1) e 26 (T2) Outubro 2007 Processamento do mrna: capping a 5, splicing e poliadenilação a 3. Reacção de capping da extremidade 5 do mrna Splicing. Tipos de intrões. Mecanismos de splicing. Referência ao self-splicing mediado por segmentos do mrna com actividade enzimática: ribozimas. Importância dos snrnas e snrnps no splicing. Noção de spliceossome. Vias de splicing. Reacções de poliadenilação e função da poliadenilação. Regulação da transcrição em eucariotas. Promotores alternativos, splicing alternativo e locais de poliadenilação alternativos. Exemplos. Lição nº17 25 (T1) e 30 (T2) Outubro 2007 Mundo do RNA. RNA editing. Exportação do mrna para o citoplasma. Diferente estabilidade dos mensageiros em células procariotas e eucariotas. A degradação do mrna como mecanismo de controlo da expressão génica pós-transcricional. Modelos dos diferentes mecanismos de degradação do mrna em procariotas e eucariotas. Principais exonucleases e endonucleases envolvidas, e sentido da degradação. Importância das estruturas secundárias e sequências de nucleótidos, sobretudo nas regiões 5 -UTR e 3 -UTR, na determinação da estabilidade dos transcritos. Silenciamento do RNA ou interferência do RNA (RNAi) como mecanismo de regulação pó-transcricional: tipos e consequências. Diferentes moléculas de RNA. Composição química do RNA e diferentes estruturas tridimensionais. Relação estrutura vs função do RNA. As diferentes moléculas de RNA na transcrição e na tradução. Síntese e propriedades dos mrnas, trnas, rrnas, snornas e snrnas. Função, processamento dos trnas e aminoacilação dos trnas. Classes de trnas. Emparelhamento wobble. rrna. Constituintes proteicos e de rrna das sub-unidades ribossomais em procariotas e eucariotas. Processamento dos rrna. Lição nº18 29 (T1) e 31 (T2) Outubro 2007 Código genético, seus desvios e ambiguidades. Tradução em procariotas e eucariotas. Três fases da tradução: iniciação, alongamento e terminação.formação dos complexos de iniciação. Sequências consensus, no mrna, do local de ligação do ribossoma (RBS). RBS nos procariotas versus scanning do início da tradução em eucariotas. Locais internos de entrada do ribossoma (IRES) em determinados mensageiros dos eucariotas. Diferentes codões de iniciação e trna met iniciador em procariotas e eucariotas. Alongamento da tradução e factores envolvidos. Local A, P e E do ribossoma. Estabelecimento da ligação peptídica Terminação da tradução. Locais funcionais nas sub-unidades dos ribossomas dos procariotas. Noção de polissoma. Tradução em eucariotas: início tradução em 5 cap vs IRES (internal ribossome entry site). Relação entre o controlo da poliadenilação citoplasmática e o início da tradução. Ex da regulação da expressão de dois genes, a dois diferentes níveis (degradação do mrna e tradução), genes estes, envolvidos no metabolismo do ferro. Regulação da tradução em procariotas e eucariotas. Acoplamento da transcrição e tradução em procariotas. Afinidade de ribossomas para RBS. Preferência de codões.

5 Lição nº19 30 Outubro (T1) e 2 (T2) Novembro 2007 Exemplo de controlo da expressão génica a nível da tradução: em E. coli, repressão da tradução do mensageiro do gene ompf pelo RNA antisense micf. Controlo diferencial da expressão da ferritina e do receptor transferrina pela proteína reguladora de resposta ao ferro (aconitase). Visão geral sobre os mecanismos de regulação da expressão génica em eucariotas. Actividade proteica: correcto folding e a acção dos chaperões, clivagem proteolítica (exemplos), e modificação química (exemplos). Degradação de proteínas. Lição nº20 5 (T1) 6 (T2) Novembro 2007 Recombinação molecular do material genético. Recombinação homóloga. Modelo de Holliday e modelos derivados. Enzimologia da recombinação. Importância da proteína RecA. Mecanismos de transferência de material genético entre microrganismos e posterior recombinação génica. Destino das moléculas de DNA transferidas. Selecção de recombinantes. Lição nº21 6 (T1) 7 (T2) Novembro 2007 Transferência de informação genética bacteriana por conjugação. O plasmídio F. Estirpes F +, F e Hfr. Integração do plasmídio F, no cromossoma de E. coli, por recombinação homóloga. Mapeamento genético. Transformação bacteriana e recombinação do DNA livre com o genoma do hospedeiro. Ciclo lítico e lisogénico. Consequências da infecção por um fago lítico e temperado. Transferência do material genético por transdução. Transdução generalizada e especializada. Integração sítio-específica do fago λ (integração tipo Campbell), no cromossoma de E. coli. Locais att. Comparação entre recombinação homóloga e recombinação sítioespecífica.