2 º Exame Engenharia Genética 31 de Janeiro de 2014 Duração: 2h30min

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1 Nome: Curso: Nº 2 º Exame Engenharia Genética 31 de Janeiro de 2014 Duração: 2h30min Bordetella pertussis é o agente causador da tosse convulsa, uma doença respiratória humana altamente infecciosa e transmissível. A conhecida produção de factores de virulência, tais como adesinas e toxinas, é apenas mais um dos mecanismos pelos quais esta bactéria causa infecção. Quando as bactérias estão expostas a limitação de nutrientes activam a denominada resposta estringente. Este mecanismo de resposta a este tipo de stresse é mediado pela acumulação da molécula sinalizadora ppgpp, também conhecida como alarmona. Os níveis intracelulares de ppgpp são modulados pela proteína alarmona sintetase RelA, que se torna activa na ausência de nutrientes como sejam os aminoácidos. Dado que o ambiente encontrado pela bactéria no hospedeiro é muitas vezes hostil e deficiente em nutrientes, os autores deste estudo investigaram a possibilidade da alarmona ppgpp ter um papel importante na patogénese de B. pertussis UT25Sm1. 1- A primeira experiência realizada pelos autores foi a sequenciação do genoma de B. pertussis UT25Sm1 com um tamanho estimado de ~4.1 Mpb. Descreva uma estratégia à sua escolha que lhe permita obter a sequência final de nucleótidos desse genoma. (1,5 valores)

2 2- Uma vez que o principal objectivo deste estudo é a caracterização da proteína RelA de B. pertussis, os autores tiveram de IDENTIFICAR A SEQUÊNCIA DO GENE rela no genoma anteriormente sequenciado. Descreva o que necessita e como proceder para atingir este objectivo. (0,75 valores) 3- Descreva as etapas principais de uma estratégia que lhe permita obter um mutante de eliminação para o gene rela usando o vector não-replicativo pss1129 (lacz, mob +, ampicilina R ) e a cassete aacc1 que confere resistência à gentamicina. (2,5 valores) 4- Tendo disponível o mutante rela de B. pertussis qual será o primeiro fenótipo a testar (que está directamente relacionado com este gene) e que condições usará para crescer as células?. (0,5 valores)

3 5- Para confirmar que o fenótipo do mutante testado em 4) se deve à ausência exclusiva do gene rela, foi efectuada uma experiência de complementação in trans. Descreva as etapas principais deste procedimento experimental, bem como eventuais controlos a usar. (1,5 valores) 6- Seguidamente, os autores testaram se a resposta estringente influenciava a resistência da bactéria ao stresse oxidativo causado por viologénio de metilo (MV) e à formação de um biofilme. Os resultados obtidos estão nos gráficos seguintes: A que conclusão chegaram os autores relativamente a cada um dos fenótipos testados? (1,0 valor)

4 7- Para compreender a relevância da molécula sinal ppgpp na formação do biofilme por B. pertussis, os autores caracterizaram o proteoma extracelular. Descreva que estirpes e extractos celulares terá de preparar, bem como as etapas experimentais até à IDENTIFICAÇÃO das proteínas diferencialmente expressas. (1,5 valores) 8- Dos resultados obtidos em 7), identificaram-se duas proteínas, Fim3 e Bsp22, como estando diferencialmente expressas. Escolha uma técnica para confirmar que efectivamente os genes fim3 e bsp22 apresentavam expressão alterada nas condições testadas. Na sua resposta refira os materiais biológicos necessários, as etapas experimentais envolvidas e o tipo de resultados que espera obter. (1,5 valores)

5 9- A proteína Bsp22 faz parte dum sistema de transporte do tipo III e está possivelmente localizada à superfície da bactéria. Como pode demonstrar a localização celular desta proteína?. Refira as etapas principais desta experiência. (1,25 valores) 10- A proteína Bsp22 autopolimeriza, formando filamentos longos essenciais para a patogenicidade em células eucarióticas HeLa. Como pode demonstrar IN VITRO esta autointeracção? Descreva a técnica a usar e como obteria o material biológico para estes estudos. (1,5 valores)

6 11- A proteína Bsp22, sendo um componente do sistema de transporte do tipo III, injecta proteínas efectoras em células eucarióticas. Para que isto aconteça, Bsp22 reconhece uma proteína receptora da superfície de células eucarióticas. Planeie uma abordagem experimental que lhe permita obter e identificar o receptor de Bsp22 em células HeLa. Na sua resposta, indique o material biológico e as etapas experimentais necessárias. (1,5 valores) 12- Seleccione a resposta correcta através de um círculo (0,5 valores cada): 1- A introdução de genes de origem diversa em plantas usa como vector o plasmídeo Ti desarmado. Isto significa que neste vector: a) Os genes onc estão ausentes b) Os genes onc estão presentes c) Toda a região do T-DNA está presente d) Os genes vir estão presentes 2- Os oligonucleótidos degenerados: a) Apresentam bases degeneradas como a inosina b) São usados para amplificar genes de sequência conhecida c) São sintetizados tendo por alvo regiões degeneradas em proteínas d) Existem devido ao código genético ser degenerado 3- Um fosmídeo é: a) Um vector de clonagem baseado no fago Lambda b) Um vector híbrido entre o fago Lambda e um plasmídeo c) Um vector híbrido entre o fago M13 e um plasmídeo d) Um vector híbrido entre o fago M13 e o fago Lambda 4- A imunidade de E. coli K contra a infecção do fago Lambda obtido em E. coli C deve-se: a) Ao sistema de modificação de E. coli K b) À ausência de metilação do fago Lambda produzido em E. coli C c) À ausência do sistema de modificação/restrição de E. coli K d) À glicosilação do DNA do fago Lambda em E. coli C

7 5- O processo mais eficiente para a obtenção de uma biblioteca genómica bacteriana é: a) In vitro packing de cosmídeos b) In vitro packing de plasmídeos c) In vitro packing do fago Lambda nativo d) In vitro packing do fago M13 6- Considere a sequência 5 ATGCCTGGACCTTAACGCGCCTAGGTATCTTGA3. Suponha que necessita de iniciadores 11-mer para PCR. Essas sequências serão: a) ATGCCTGGAC e TCAAGATACCT b) TACGGACCTGG e TCAAGATACCT c) ATGCCTGGACC e TCCATAGAACT d) ATGCCTGGACC e TCAAGATACCT 7- Os resultados obtidos por PCR podem ser analisados por: a) Separação electroforética em gel b) Electroforese capilar c) Detecção da fluorescência emitida por fluoróforos d) Todos os anteriores 8- Como pode E. coli excretar uma proteína recombinante para o meio de cultura? a) Clonando o gene de interesse e um péptido sinal na mesma grelha de leitura b) Clonando adicionalmente ao gene de interesse, um gene que codifica para um transportador c) Clonando adicionalmente ao gene de interesse, um gene que codifica para uma proteína chaperona d) Clonando adicionalmente ao gene de interesse, um gene que codifica para uma proteína secretase 9- No Sistema de dois híbridos na levedura, a expressão do gene lacz indica que: a) Uma proteína teste regula a expressão da outra no híbrido com activação do gene lacz b) Uma das proteínas teste e o domínio de activação se ligaram à região UAS c) As duas proteínas teste interagiram uma com a outra d) Ambos os genes do híbrido formam um operão que activa a expressão do gene lacz 10- A principal vantagem da medicina nuclear relativamente a outras técnicas de imagiologia médica é: a) Custo acessível b) Profundidade de penetração ilimitada c) Exposição de pacientes à radiação d) Elevada resolução espacial