Aula 8: Seleção de clones e screening bancos de bibliotecas genômicas

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO PÓLO AVANÇADO DE XERÉM GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA CURSO MELH. GEN. E OGMs (XBT353) TURMA 2014/1 Aula 8: Seleção de clones e screening bancos de bibliotecas genômicas Prof. Dr. Silas Pessini Rodrigues Rio de Janeiro, 08 de abril de 2014

2 Seleção: um tipo de pressão (ex.: presença de anti-biótico) é aplicada sob as células hospedeiras pré-expostas à DNA recombinante as células contendo o DNA de interece sobrevivem e são selecionandas. Screening: Uma população de células viáveis é submetida a testes específicos que permitem a identificação de indivíduos da população que contêm o DNA de interesse.

3 Seleção genética e métodos de screening Baseiam-se na expressão ou não de uma determinada característica codificada pelo vetor ou pelo DNA inserto Principais métodos de screening: 1. Uso de substratos cromogênicos 2. Inativação por inserção 3. Complementação de mutações 4. Hibridização de ácidos nucléicos 5. PCR 6. Imunológico

4 1. Uso de substratos cromogênicos na seleção genética Sistema X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl--Dgalactopyranoside) Susbtrato incolor da β-galactosidase (β-gal) β-gal sintetizada em E. coli na presença de galactose ou indutores (ex.: IPTG, iso-propyl-thiogalactoside) β-gal codificada pelo gene LacZ Estão associadas também à selecão por antibióticos o antibiótico seleciona células que receberam o plasmídeo e o subtrato cromogênico seleciona as que receberam o inserto

5 A clivagem do substrato x-gal gera um produto de cor azul Oxidação no ar

6 Alguns vetores podem trazer o gene LacZ completo (LacZ) ou parcial (LacZ ) Vetor lambda Charon 16A A célula hospedeira que não codifica o gene LacZ (fenótipo LacZ-) só vai expressar o fenótipo se a célula conter o vetor

7 LacZ+ Tem o vetor! LacZ- Não tem o vetor!

8 Alguns vetores podem trazer o gene LacZ complecto (LacZ) ou parcial (LacZ ) Plasmídeo puc18 Sistema de α-complementação: N-terminal, tetrâmero sítio ativo α-peptide interface entre as duas sub. dos tetrâmeros resíduos estabilizam as 4 hélices e os resíduos 13 e 15 contribuem para o sítio ativo E. coli β-gal

9 Sistema LacZ de complementação com α-peptídeo

10 2. Inativação por inserção: o inserto de DNA inativa um gene no vetor Tem o vetor intacto! Tem o vetor + inserto!

11 2. Inativação por inserção: sistema de resistência à antibióticos Inserto aqui Células = Ap Suceptíveis Tc Resistentes

12 2. Inativação por inserção: sistema de resistência à antibióticos Inserto aqui Ap R Células = Ap Suceptíveis Tc Resistentes Células de interesse!

13 3. Complementação de mutações Complementação: o DNA clonado codifica uma função auxente na célula hospedeira Requerimentos: 3.1 Uma sepa de hospedeiro mutanto em um gene particular (auxotrófico) 3.2 Um meio de cultura específico em que aquela sepa cresça 3.3 A forma funcional do gene tem que ser expressa no hospedeiro Hospedeiro auxotrófico: incapaz de sintetizar um composto particular requerido para o seu crescimento

14 Microalga Chlamydomonas reinhardtii auxotrófica para o Arginina Células em meio sem arg ou não transformadas Células em meio com arg ou transformadas C. reinhardtii Cc1618- falta um gene de síntese de arginina

15 Outros métodos de seleção genética ci intacto forma lisógenos ci + inserto de DNA célula sofrem lise formam placas bacterianas Sistema repressor ci de fago lambda Genes que controlam a mudança entre os ciclos lisogênico e lítico: ci repressor do ciclo lítico Cro controla o repressor e outros genes induz ciclo lítico Ex.: vetor λgt10

16 Apenas células infectadas por vetor+inserto formarão placas bacterianas (regiões de ciclo lítico), quando suspensões diluídas de fagos forem aplicadas sobre as bacterias Placa bacteriana, de onde bacteriófagos são isolados e podem ser re-cultivados em bactérias crescendo em meio líquido

17 4. Screening por hibridização de ácidos nucléicos Baseadas na complementaridade de ácidos núcleis em dupla fita Envolve o uso de sondas a sonda apresnta um determinado grau de homologia em relação à sequência alvo As sondas podem ser marcadas com 32 P ou por fluorescência Sonda heterólogas baseada na sequência de DNA de um organismo, quando aplicada em uma espécie diferente. As sondas são de três tipos: 1) DNA genômico 2) cdna pode ser utilizada diretamente à partir de uma população de mrna sem a necessidade de clonagem prévia 3) Oligonucleotídeos sintetizados à partir da sequência da proteína

18 De que forma as sondas podem ser marcadas? -Polimerase incorpora nucleotídeos marcados -Pode utilizar: Nucleotídeos radioativos Nucleotídeos marcados quimicamente Timina modificada Dioxigenina pode ser detectada por anticorpo

19 De que forma as sondas podem ser marcadas? - O DNA pode ser tratado com uma 5 kinase

20 4. Screening por hibridização de ácidos nucléicos Estringência: O quanto acurada uma sonda vai ser

21 Placas em alta e baixa densidade são utilizadas para screening O screening é feito em placas com populações densas de células, que são recultivadas para permitirem o isolamento de células individuais

22 Sondas baseadas em mrna podem ser obtidas à partir de células em que a expressão do gene é conhecida + probe = contêm o mrna do gene de interesse - probe = não contêm o mrna do gene de interesse A2 e E3 = interessantes para validação

23 O desenho de oligonucleotídeos à partir da sequência da proteína

24 O uso de inosina diminui a possibilidade de sequências no primer ou na sonda

25 Placas em alta e baixa densidade são utilizadas para screening O screening é feito em placas com populações densas de células, que são recultivadas para permitirem o isolamento de células individuais

26 Screening utilizando-se PCR: feito na forma de teste combinatório Colônia positiva: 5C O objetivo do teste combinatório é reduzir o número de reações de PCR.

27 Chromossome walking permite que segmentos do DNA cromossomal possam ser sequenciados No contexto da trangenia, o mesmo princípio é utilizado na determinação das sequências genômicas adjacentes ao inserto de DNA isso permite a determinação se o inserto 1) alterou algum gene importante da planta ou 2) se um gene com características indesejadas foi criado/alterado (ex.: potencial alergênico)

28 Screening imunológico é utilizado na detecção do produto do gene Anticorpo antígeno Anticorpo polyclonal: reconhecem todos os determinantes de um antígeno Anticorpo monoclonal: reconhecem um único determinante antigênico (muito mais específico e difícil de se obter) Utilizados para a detecção do produto do gene são aplicados a bibliotecas de expressão

29 Análise da expressão gênica por imunologia

30 O nível de expressão e o número de vezes que o gene foi inserido no genoma do hospedeiro pode ser determinado por um conjunto de técnicas RT-PCR Blotting Southern-blot alvo são moléculas de DNA Northen-blot alvo são moléculas de RNA Western-blot alvo são proteínas

31 RT-PCR semi-quantitativo: estima o nível de expressõ gênica Fase logaritmica = usada para quantificação relativa LEC12 e LEC29 dois tipos celulares GAPDH- housekeeping gene, gliceraldeido 3-P desidrogenase Fut9 gene de interesse

32 Blottings fornecem informações sobre os níveis de expressão e o número de cópias do gene que o hospdeiro carrega Southern-blot revela o número de insersões no genoma do hospdeiro

33 Exemplo de resultado de Southern-blot Plantas de arroz transformadas com gene da glioxalase I P, Plasmid DNA; NT, non-transgenic rice plant.

34 Exemplo de resultado de northern-blot Cre gene expression in different parts of transgenic and non-transgenic plants; lanes 1-4 showing the flower, stem, leaf and root of a transgenic plant (R63), 5-8 non-transgenic plant Cao B, Huang Z, Chen G, Lei J - Genet. Mol. Biol. (2010)

35 Western-blot detecta o produto do gene por imunologia

36 Exemplo de resultado western-blot

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38 Avaliação - Seminários Cada tema será apresentado em dupla. Os alunos presentes na aula do dia 08/abril poderão escolher as duplas. Os ausentes serão agrupados pelo professor por ordem de chamada; Cada dupla terá 30 min para apresentação do tema. Os dois alunos devem participar; Os seminários deverão ser apresentados em formato powerpoint. Os slides devem conter as referências; A pesquisa dentro de cada tema deve ser guiada pelos seguintes pontos: 1- Aplicação geral do melhoramento genético/ogms ao tema; 2- Listar e explicar exemplos de OGMs produzidos no contexto do tema do seminário; 3- Escolher um dos exemplos listados e apresentar detalhes que contemplem: 3.1- Qual foi a fonte de germoplasma, matriz ou sepa utilizada para o melhoramento ou produção do OGM? Por quê? 3.2-Que característica(s) foi(ram) melhorada(s) ou alterada(s) geneticamente? Em que contexto? 3.3-Qual foi a estratégia de clonagem utilizada? 3.4-Qual foi a tecnologia do DNA recombinante (vetor+plasmídeo+sistema de seleção) utilizada? Explicar as possíveis razões para a escolha do método específico.

39 Os seminários serão apresentados nos dias: Temas : /maio /maio A ordem de apresentação obedecerá a ordem da lista de temas; Os alunos deverão entregar a estrutura do seminário em tópicos, contemplando os pontos descritos no ítem anterior. Este documento não deverá ultrapassar uma página, e deverá ser impresso e entregue ao professor durante a aula dos dias: Temas: 1-7 6/maio /maio A pontuação do seminário (total 10 pontos) será assim distribuída: Entrega da estrutura do seminario: 2,0 Conteúdo: 3,0 *Apresentação: 3,0 *Preparação dos slides: 2,0 *Apenas estas notas serão específicas por aluno. Orientação por srodrigues@xerem.ufrj.br ou por agendamento.

40 Temas dos seminários: 1- Microalgas e biodiesel 2- Plantas e biodiesel 3- Resistência de plantas à herbicidas e inseticidas 4- Resistência de plantas à seca 5- Resistência de plantas à patógenos virais 6- Resistência de plantas à patógenos fúngicos 7- Plantas com maior valor nutricional 8- Plantas com melhor uso de fertilizantes/agentes químicos 9- Produção de hormônios humanos 10- Cultura e engenharia de tecidos 11- Controle da maturação de frutos 12- Plantas e controle de pragas 13- Produção de anticorpos humanos

41 Dulpas de alunos Número do tema Camila e Ana Paula 2 Dandara e maria Fernanda 9 Amanda e Daniella Paiva 10 caroline e Marco Antônio 11 Ana Caroline e Marcella Almeida 8 Marcela Guimarães e Gabriele 13 Nathally e Aghata 4 Daniela e Raquel 12 Diego e Nathália 1 João Luis e Ayra 3 Júlia e Laís 5 Caroline Andrade e Ingrid 6 *Jamille 7 *Poderá fazer junto com qualquer uma das outras duplas, ou poderá fazer o trabalho individualmente