Unidade III: Tecnologia do DNA Recombinante

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1 Unidade III: Tecnologia do DNA Recombinante Disciplina: Biologia Molecular Centro de Ciências da Saúde Docente: Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini Pró-Reitoria de Pesquisa e de Pós-graduação Bloco L marilanda.bellini@usc.br

2 DNA recombinante Enzimas de restrição Vetores de clonagem Plasmídios Bacteriófagos Cosmídeos Conteúdo Etapas de clonagem molecular Bibliotecas de DNA Aplicações

3 Brincando de Deus Às vezes, você se pega pensando se isto é resultado de algum experimento maluco? J.B., tem alguém aqui reclamando que os genes que patenteamos foram criados pelo chefe dele.

4 DNA Recombinante É uma molécula de DNA formada pela ligação de duas moléculas de origens diferentes.

5 1982 Diabetes mellitus DNA Recombinante

6 Enzimas de Restrição 1970: DNA de bacteriófago é impedido de replicar em Escheria coli 1978: Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina

7 Enzimas de Restrição Enzimas Bacterianas Protegem Bactéria contra Infecção Viral Degradam DNA viral Proteção DNA Bacteriano (Metilação)

8 Enzimas de Restrição ou Endonucleasede Restrição cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídiosque seja o sítio de restrição da enzima; Sítio-específica

9 Enzimas de Restrição Nomemclatura: Gênero EcoRI Ordem de descoberta Espécie Linhagem Enzima Organismo Sequência b AluI Arthrobacter luteus 5 AG CT BamHI Bacillus amyloliquefasciens H 5 G GATCC HaeIII Haemophilus aegyptius 5 GG CC HindIII Haemophilus influenzae Rd 5 A AGCTT EcoRI Escherichia coli RY13 5 G AATTC

10 Enzimas de Restrição Propriedades: Reconhecem Palíndromos ou Sequências Palindrômicas Sequenciade pares de nucleotídeos que tem a mesma leitura em ambos os sentidos, a partir de um eixo central de simetria

11 Enzimas de Restrição Eixos de Clivagem: a) Clivagem no eixo de simetria b) Clivagem simétricamente situada ao redor do eixo de simetria...tc GA......AG CT......GAA TTC......CTT AAG Fragmentos de restrição com extremidades abruptas Fragmentos de restrição com extremidades coesivas

12 Enzimas de Restrição

13 Enzimas de Restrição Vídeo

14 Vetores de Clonagem Organismos utilizados para transferir DNA/RNA para uma célula hospedeira. Propriedades: Replicação autônoma Marcador de seleção (antibiótico) Sítio único de clonagem Tipos: Plasmídeos: Bacteriófagos: Cosmídeos:

15 Vetores de Clonagem Tipos: Plasmídeos: moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossomais, que ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras puc18 pbr322 pup310 Utilizados para clonar fragmentos de até 9 kb

16 Vetores de Clonagem Tipos: Bacteriófagos: Vírus que infectam bactérias; são usados para clonar fragmentos de DNA de pares de bases.

17 Vetores de Clonagem Tipos: Cosmídeos: são estruturas híbridas que possuem características do bacteriófago e plasmídeos. Vantagens: capacidade do plasmídeo de replicação autônoma capacidade do fago de embalagem do cromossomo são utilizadas para a clonagem dos maiores segmentos de DNA.

18 Clonagem Produção de organismos geneticamente idênticos.

19 Passos para Clonagem 1. Obtenção do DNA a ser clonado 2. Preparação do vetor 3. Ligação do vetor com o inserto 4. Transformação da bactéria 5. Seleção dos clones recombinantes

20 Passos para Clonagem 1. Obtenção do DNA a ser clonado Extração de DNA; (Aula Prática) Digestão com Enzimas de Restrição; PCR; (realizaremos em Aula Prática, com o DNA PCR; (realizaremos em Aula Prática, com o DNA extraído previamente)

21 Passos para Clonagem 1. Obtenção do DNA a ser clonado Digestão com Enzimas de Restrição

22 Passos para Clonagem 1. Obtenção do DNA a ser clonado PCR - Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase) 1983, Kary B. Mullis 1993 Prêmio Nobel em Química Amplifica o número de cópias de uma região específicadodna Replicação seletiva de fragmentos de DNA genômico.

23 Passos para Clonagem O processo do PCR é composto de ciclos, contendo os seguintes passos:

24 Passos para Clonagem O processo do PCR é composto de ciclos, contendo os seguintes passos: Denaturação: O DNA é aquecido para quebrar as pontes de hidrogênio entre as fitas complementares, permitindo a separação das fitas.

25 Passos para Clonagem O processo dopcr é composto de ciclos, contendo os seguintes passos: Anelamento: Fitas separadas, o DNA é resfriado para permitir que os primers, se liguem nas seqüências complementares específicas (não necessariamente TATA Box) do molde.

26 Passos para Clonagem O processo do PCRé composto de ciclos, contendo os seguintes passos: Extensão: DNA polimerasecomeça a estender os primersna direção 5 3, pela adição de nucleotídeos usando as fitas do DNA molde como modelo.

27 Passos para Clonagem O processo do PCRé composto de ciclos, contendo os seguintes passos: Processo é repetido por vários ciclos, dependendo da quantidade de DNA necessário.

28 Passos para Clonagem Visualização do Produto de PCR Eletroforese em gel: é o processo no qual moléculas são separadas de acordo com o tamanho e carga elétrica pela aplicação de uma corrente elétrica. A corrente elétrica força as moléculas pelos poros de uma camada fina de gel. Fragmentos menores, geralmente movem-se mais rápidos que os maiores.

29 Passos para Clonagem Visualização do Produto de PCR Eletroforese em gel:

30 Passos para Clonagem 2. Preparação do Vetor: Plasmídeo Circular Plasmídeo linear Digestão com Enzimas de restrição

31 Passos para Clonagem 3. Ligação Extremidades coesivas DNA plasmidial -vetor Fragmento de DNA -inserto LIGASE

32 Passos para clonagem 4. Transformação Bacteriana Choque Térmico: 3) Choque Térmico (37 o a 42 o C) poros na membrana entrada do vetor 2) Neutralização de cargas (-) da membrana e do DNA 1) Tratamento com CaCl 2

33 Passos para clonagem 4. Transformação Bacteriana Eletroporação: 3) Alta voltagem poros na membrana entrada do vetor 2) Competentes a receber DNA 1) Solução aquosa

34 Passos para Clonagem 5. Seleção dos Clones Recombinantes Plaqueamento Multiplicação e Crescimento de Colônias Seleção

35 Clonagem Vídeo sobre clonagem:

36 Biblioteca de DNA Coleção de fragmentos de restrição clonados a partir do genoma de um único organismo. Biblioteca genômica; Biblioteca de cdna;

37 Biblioteca de DNA Biblioteca genômica: biblioteca de DNA contendo o genoma completo de um organismo. Estudar a função de sequências reguladoras; Estudar a natureza de como íntrons/éxons afetam oprodutofinal(aproteína)deumgene.

38 Biblioteca de cdna: cdna DNA complementar, copiado diretamente do mrna. TranscriptaseReversa: polimeriza moléculas de DNA a partir de moléculas de RNA, exatamente o oposto do que geralmente ocorre nas células, nas quais é produzido RNA a partir de DNA. Biblioteca de DNA

39 Biblioteca de cdna: Biblioteca de DNA cdna não contêm íntrons ou qualquer seqüência anterior ou posterior do gene. Toda biblioteca de cdnaé feita a partir de um tecido. Contêm somente a representação das sequências transcritas naquele tecido. É possível isolar cdna de beta-globina a partir de uma biblioteca de cdna de fibroblastos da pele?

40 Biblioteca de DNA Biblioteca de cdna: Estudos de expressão; Determinar a função dos genes na célula eucariótica; Comparação com seqüências genômicas; Etiquetar genes com suas proteínas respectivas. Qual Gene? Qual Proteina? ESTs(ExpressedSequenceTags): pequenos fragmentos de cdna.

41 Aplicações Farmacogenômica; Vacinas Recombinantes; Terapia Gênica; Transgênicos; Próximas Aulas

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43 Referências Bibliográficas Nussbaum R.L.; McInnes R.R., Willard H.F. Thompson &Thompson Genética Médica, 7ª. Edição, Elsevier Saunders, 2008 capítulo 4 Watson J.D. DNA, O Segredo da Vida. Companhia das Letras, 2005 capítulo 4 Snustad D.P.; Simmons M.J. Fundamentos de Genética, 2ª. Edição, Guanabara Koogan, 2001 capítulo 20 Alberts B. et al. Biologia Molecular da Célula, 3ª. Edição, Artmed, 1997 capítulo 7 Costa S.O.P. Genética Molecular e de Microrganismos Os Fundamentos da Engenharia Genética, Manole, 1987 capítulo 32 Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Conceitos Básicos de Técnicas em Biologia Molecular. Embrapa, 2008