Determinação da Estrutura de Proteínas

Transcrição

1 Centro Brasileiro-Argentino de Biotecnologia Introdução à Biologia Computacional Determinação da Estrutura de Proteínas Paulo enrique C. Godoi

2 Bioinformática objetivo principal é determinar a função de todos os genes no genoma; Proteínas produtos de genes, constituem não apenas as estruturas físicas mas também uma complexa rede de reações químicas que mantém os organismos vivos; Estrutura de Proteínas responsável pela função Determinado pela seqüência de aminoácidos, derivados da transcrição e tradução do DNA; A seqüência de aminoácidos será, em grande parte, o determinante no enovelamento de proteínas;

3 ...AUCCGAUUCGGCUACUGAUCGAGCUACUGCAACCUGCAGUGACGU... mrna 1...DLTRNMTRAPMIDMI... proteína 2 3

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5 Métodos para a determinação da estrutura de proteínas: 1. cristalografia de raios-x (experimental) modelo estático 2. ressonância magnética nuclear (experimental) modelo dinâmico 3. modelagem molecular por homologia (teórico) baseado em conhecimento prévio 4. ab initio (teórico) totalmente teórico com algumas restrições

6 Cristalografia de raios-x de proteínas RMN vantagens e desvantagens não há limite para o tamanho da(s) molécula(s) em estudo; i.e. Desde que sejam cristalizadas 2. a solubilidade é menos crítica 3. definição simples de resolução 4. cálculo direto dos dados para a densidade eletrônica 5. a amostra (cristais) sofrem com danos causados pela radiação aplicada 6. problema das fases 1. amostras analisadas em solução! mas com limite máximo de cerca de 30kDa. Eliminando cerca de 50% das proteínas 2. análise dinâmica das interações entre proteínas / substratos / outros ligantes 3. a solubilidade é crítica! 4. a amostra não é danificada durante as medidas 5. não há o problema de fases equipamentos caros! Método ideal?

7 Cristalografia de raios-x de proteínas etapas experimentais extração ou expressão em sistema heterólogo; 2. purificação; 3. cristalização; 4. coleta de dados de difração de raios-x; 5. cálculo de fases e mapas de densidade eletrônica; 6. construção e refinamento de um modelo molecular; 7. análise da estrutura;

8 Notas: expressão Análise da seqüência de aminoácidos e modificação quando apropriado (engenharia) para facilitar a purificação / cristalização; Escolha do hospedeiro e do sistema de expressão desejável: alta solubilidade em soluções tampão Notas: purificação Estabilidade e integridade estrutural (nova definição de pureza) rendimento alto: >95% pureza / miligramas de proteínas

9 Cristalização

10 Coleta de dados Tamanho: 0,01 a mais de 1,0 mm Coleta de dados em condições criogênicas temperatura: 10 a 100K (-263 a -173 o C)

11 Coleta de dados

12 Coleta de dados Radiação síncrotron ESRF, ID14 Goniômetro

13 Coleta de dados Thi1-P, ESRF ID29

14 Função de densidade eletrônica e o problema das fases

15 Resolução do problema das fases

16 Cristalografia e RMN

17 Ressonância Magnética Nuclear ~~~~ ~~~~ ~~~~ pulsos de rádio Tempo de Relaxação

18 Ressonância Magnética Nuclear O C3 N O O O C 3 N O N O Proteína de ligação de ácido graxo intestinal sobreposição de 20 estruturas

19 Ressonância Magnética Nuclear 900 Mhz NMR (Oxford 21.1 tesla magnet) / Varian console

20 Modelagem Molecular por omologia Proteínas com seqüências de aminoácidos similares devem apresentar enovelamentos similares. Etapas: 1. alinhamento entre as seqüências de proteínas homólogas com estrutura já determinada (cristalografia ou RMN); 2. alinhamento com o alvo; 3. análise do ambiente químico, aplicação de restrições espaciais, reconstrução de loops e minimização de energia;

21 Ab initio Quando não há modelos em banco de dados de estruturas de proteínas para a modelagem molecular por homologia Em geral: 1. necessária amostragem de todo o espaço conformacional da proteína-alvo, de maneira a produzir-se um grande número de possíveis conformações nativas; 2. determinação de uma função de discriminação/pesos/energia para distinguir entre conformações nativas e não-nativas;