1 º Exame de Engenharia Genética/ Biotecnologia Molecular 9 de Janeiro de 2016 (Duração: 2h30min).

Transcrição

1 Nome: Curso: Nº 1 º Exame de Engenharia Genética/ Biotecnologia Molecular 9 de Janeiro de 2016 (Duração: 2h30min). As infecções da corrente sanguínea são muitas vezes causadas por estirpes patogénicas de Klebsiella pneumoniae e estão associadas a alta morbidez e mortalidade. Estas bactérias quando presentes na corrente sanguínea são capazes de resistir aos mecanismos de defesa do hospedeiro, incluindo a fagocitose, o sistema do complemento, e a presença de péptidos antimicrobianos. A activação do sistema do complemento presente no soro sanguíneo resulta numa cascata de clivagem enzimática e na interacção entre proteínas do complemento, que são depositadas na superfície da bactéria, formando complexos de ataque à membrana que criam poros transmembranares causadores da lise osmótica das células bacterianas. Por outro lado, certos factores de virulência da bactéria antagonizam a actividade bactericida do complemento sérico. Um tal exemplo é a cápsula K5 de origem polissacarídica que está firmemente ligada à superfície da célula. A estirpe K. pneumoniae CFT073 é um isolado típico de infecções sanguíneas e é resistente aos efeitos bactericidas do soro. Para entender como esta estirpe se adapta e sobrevive no sangue humano, os autores deste estudo efectuaram várias experiências nas quais as bactérias foram incubados em soro humano normal (NHS) ou soro inactivado pelo calor (HIS). 1- Foi previamente demostrado que a estirpe CFT073 (CFT) resiste ao efeito bactericida do soro a 10% e que a incapacidade de produzir a cápsula K5 (CFT kpsc) resulta num decréscimo da viabilidade celular. A fim de estabelecer se a estirpe CFT073 resiste a concentrações séricas mais elevadas, efectuaram-se ensaios de morte na presença de 50 % de soro (o meio de cultura é constituído por 50 % de LB e 50 % de soro). A figura 1 mostra o resultado obtido: Indique qual o procedimento experimental seguido e quais as principais conclusões a que os autores chegaram (1,0 valor).

2 2- Para continuar seu estudo, os autores sequenciaram o genoma desta estirpe de K. pneumoniae CFT073. Use a tecnologia desenvolvida pela empresa Illumina e descreva todas as etapas desta experiência até à obtenção da sequência de nucleótidos completa deste genoma (2,0 valores). 3- A viabilidade do mutante de eliminação CFT kpsc não desceu para o valor zero quando exposto a soro (tal como se mostra na figura 1), sugerindo a existência de outros mecanismos de resistência ao soro para além da cápsula K5. Para identificar esses outros mecanismos, os autores determinaram o transcriptoma da estirpe CFT073 na presença de 50% de soro (NHS ou HIS). a) Com base na figura 1, qual o melhor tempo para recolha da amostra a utilizar nesta experiência? Porquê? (0,5 valores). b) Usando arrays GeneChip da Affymetrix para K. pneumoniae CFT073, descreva todos os passos deste procedimento experimental até à obtenção dos valores de expressão global (1,75 valores).

3 4- Como resultado da experiência anterior, os autores identificaram dois genes de K. pneumoniae com expressão aumentada na amostra contendo NHS. Um deles, rcsb, codifica para um regulador de resposta pertencente a um sistema regulador de dois componentes e o outro, wcad, está envolvido na biossíntese de um polissacarídeo extracelular. Para confirmar o envolvimento destes genes na resistência ao soro, foi necessário construir dois mutantes de eliminação. a) Usando o vector não replicativo pkd44 (lacz +, gusa +, mob +, canamicina R ), descreva todos os passos para a obtenção desses mutantes de eliminação (refira a estratégia para apenas um mutante) ( 2,5 valores).

4 b) Para complementar os dois mutantes de eliminação anteriormente construídos pode-se usar como base o plasmídeo replicativo pbbr1mcs (cloranfenicol R, lacz +, mob + ). Descreva todas as etapas desta experiência, incluindo a clonagem e o ensaio fenotípico para avaliar o fenótipo dos mutantes bem como a sua complementação (1,5 valores). c) A figura abaixo mostra os dados obtidos para a complementação dos mutantes com o vector vazio ou com o respectivo gene clonado. Quais são as principais conclusões que se podem tirar? Poder-se-à colocar a hipótese de WcaD ser um membro da regulão da proteína RcsB? Porquê? (0,75 valores).

5 5- Os autores colocaram a hipótese da proteína RcsB se ligar à região promotora do gene wcad e desta forma activar a sua expressão. a) Proponha uma experiência para testar essa possível actividade de ligação de RcsB. Deve incluir na sua resposta a técnica de surface plasmon ressonance e descrever detalhadamente todas as etapas desta experiência incluindo a preparação do material biológico necessário (1,75 valores). b) Proponha uma experiência para determinar os níveis da proteína WcaD na presença ou ausência do gene rcsb, referindo o material biológico que necessita (1,25 valores).

6 6- É ainda possível que a cápsula K5 e o polissacarídeo extracelular actuem sinergicamente para proteger K. pneumoniae CFT073 do efeito bactericida do soro. Proponha uma experiência para testar esta hipótese e desenhe um gráfico para a hipótese afirmativa (use ambos os soros NHS e HIS) (1,0 valor). 7- Seleccione a resposta correcta desenhando um círculo (0,5 valores cada): 1- A primeira etapa da técnica de PCR é efectuada a 95ºC durante 30 segundos. O que acontece ao DNA a esta temperatura?: a) As cadeias de DNA separam-se b) As cadeias simples de DNA ligam-se aos oligonucleótidos iniciadores c) A cadeia de DNA complementar é sintetizada pela DNA polimerase adicionando dntps ao iniciador d) A etapa do PCR repete-se outra vez 2- Em que fase do PCR são adicionados à cadeia de DNA em crescimento os nucleótidos trifosfato?: a) Na extensão das cadeias b) Na ligação dos iniciadores c) Na desnaturação das cadeias d) Na preparação da reacção 3- O(s) objectivo(s) da hibridação de Southern pode(m) ser: a) Procurar uma sequência de nucleótidos específica no DNA a ser testado b) Determinar o grau de proximidade filogenética de dois organismos c) Identificar o tamanho do fragmento de DNA que contém a sequência de interesse d) a e c e) a, b e c

7 4- Considere as endonucleases de restrição BamHI (G GATCC), BglII (A GATCT) e Sau3A ( GATC). Se um vector for linearizado com BamHI, o gene a ser clonado nesse vector pode ser digerido com: a) Somente BglII b) Somente Sau3A c) BglII e Sau3A d) Nenhuma das anteriores 5- Numa separação electroforética por campo pulsado, quanto mais pequeno for um fragmento de DNA: a) Mais perto da origem ele fica b) Mais brilhante quando corado com DsRed ele fica c) Mais rapidamente migra durante a separação electroforética d) Mais lentamente migra durante a separação electroforética 6- Endonucleases de restrição que reconhecem a mesma sequência de nucleótidos chamam-se: a) Isosquizómeros b) Isómeros c) Palíndromos d) Plasmossomas 7- Um elemento genético autónomo que se pode mover dentro de uma célula, mas não entre células é um: a) Plasmídeo b) Fago c) Epissoma d) Transposão 8) Uma estirpe de E. coli é trp -, his -, leu +, lac +. Em qual dos meios de cultura é capaz de crescer?: a) Lactose + histidina + triptofano b) Lactose + histidina + leucina c) Lactose + triptofano + leucina d) Todas as anteriores e) Nenhuma das anteriores 9) O RNA em cadeia dupla é usado em biologia molecular como: a) Um método para duplicar a expressão de genes b) Uma ferramenta experimental para silenciar genes de uma forma específica c) Um método que não afecta a expressão de genes d) Uma ferramenta experimental para degradar DNA de uma forma específica 10) A principal vantagem da Medicina Nuclear relativamente a outras técnicas de Imagiologia médica é: a) Custo acessível b) Profundidade de penetração ilimitada c) Exposição de pacientes à radiação d) Muito alta resolução espacial 11) O proteoma dos pulmões dos indivíduos com FQ representa: a) Todas as proteínas codificadas pelo genoma humano b) A maioria das proteínas expressas pelo genoma de um indivíduo com FQ c) Proteínas expressas no tecido pulmonar de um indivíduo com FQ num determinado momento no tempo d) Proteínas codificadas pelo genoma de células de pulmão humano num determinado momento no tempo 12) Se tiver a sequência 5 ATGCCTGGACCTTAACGCGCCTAGGTATCTTGA3 e necessitar de oligonucleótidos iniciadores 11-mer, as suas sequências são: a) ATGCCTGGAC e TCAAGATACCT b) TACGGACCTGG e TCAAGATACCT c) ATGCCTGGACC e TCCATAGAACT d) ATGCCTGGACC e TCAAGATACCT