1 º Teste de Engenharia Genética 7 de Novembro de 2015; Duração máxima: 2h

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1 1 Nome: Curso: Nº 1 º Teste de Engenharia Genética 7 de Novembro de 2015; Duração máxima: 2h As infecções contraídas em hospitais devido a bactérias resistentes a múltiplas drogas (MDR) são um dos maiores desafios actuais em termos da segurança dos doentes. Um dos organismos muitas vezes associado a estas infecções é Acinetobacter baumannii. Esta bactéria é responsável por várias doenças em indivíduos susceptíveis, incluindo pneumonia, septicémia e infecções em feridas. Um estudo recente mostrou que as infecções hospitalares causadas por A. baumannii são MDR e que estirpes resistentes a todos os antibióticos usados em clínica são cada vez mais frequentes. Como tal, a compreensão dos mecanismos de patogenicidade desta bactéria poderá ajudar no desenvolvimento de estratégias de controlo e de prevenção destas infecções. Em termos laboratoriais, podem ser efectuadas testes de virulência por recurso larvas da mariposa Galleria mellonella, incapaz de sobreviver quando infectadas por estirpes de A. baumannii virulentas. Dada a frequência destas infecções hospitalares, os autores de um estudo efectuaram as seguintes experiências: 1- Para identificar possíveis determinantes que contribuam para a patogenicidade desta bactéria (A. baumannii ATCC 17978), foi preparado um banco de mutantes através do uso do plasposão ptnmod-okm (orir, orit, canamicina R ). a) Explique o que é um plasposão e a razão pela qual pode ser usado em experiências de mutagénese (1,0 valor) b) Imagine que o banco de mutantes tem 2000 colónias differentes. Como pode identificar os mutantes de interesse para prosseguir os estudos de virulência em A. baumannii? (1,0 valor).

2 2 c) Da análise prévia chegou-se à conclusão que o mutante mtn5-333 parece ser interessante para prosseguir estudos. A sequência do plasposão indica não haver locais de reconhecimento para a endonuclease de restrição PstI. Explique as etapas principais para a identificação do local no genoma do mutante de A. baumannii onde esse plasposão se inseriu (1,5 valores). 2- O mutante mtn5-333 tem o plasposão inserido no gene wzc que codifica para uma tirosina autocinase envolvida na produção de polissacárido extracelular (veja a figura) Para estudar a função deste polissacárido na virulência de A. baumannii, foi necessário preparar um mutante de eliminação wzc. a) Porquê? (justifique com base na figura) (0,5 valores) b) Refira uma estratégia à sua escolha para obtenção desse mutante de eliminação usando no processo de clonagem a técnica de Gibson assembly, referindo quais as actividades enzimáticas envolvidas neste processo e restantes materiais biológicos (2,0 valores).

3 3 c) Descreva uma experiência de complementação para o mutante obtido em b) tendo como base o vector de clonagem PMMBH66HE (vasta gama de hospedeiros, lacz +, ampicilina R ), incluindo os resultados expectáveis (1,5 valores). 3- A tirosina autocinase Wzc de A. baumannii determina o tamanho das cadeias do polissacárido. Para identificar quais os aminoácidos relevantes na actividade desta proteína, efectuou-se uma experiência de mutagénese dirigida. A figura seguinte mostra os domínios conservados (Walker A, A, B e agrupamento de tirosinas) bem como os aminoácidos substituidos.

4 4 a) Descreva o material biológico e procedimento experimental para a introdução dessas mutações no gene wzc (nota: com excepão para a Y, todas as mutações são individuais) (1,5 valores). b) As proteínas Wzc mutadas foram usadas para testar a sua capacidade de autofosforilar resíduos de tirosina. A figura seguinte mostra a autofosforilação de Wzc através do uso de um anticorpo que detecta resíduos de fosfotirosina. Interprete os dados obtidos e refira quais terão sido as conclusões dos autores (1,0 valor).

5 5 4- Numa outra experiência, os autores testaram a influência da produção de polissacárido (medida pelo tamanho das colónias) na resistência a antibióticos. Usaram para tal, concentrações sub-inibitórias de rifampicina (Rif) e eritromicina (Em). Obtiveram o seguinte resultado: a) O que puderam concluir sobre a produção de polissacárido e a resistência a antibióticos? (1,0 valor) b) Coloque uma hipótese e planeie uma experiência que lhe permita perceber o mecanismo pelo qual a produção de polissacárido influência a resistência a antibióticos (0,5 valor). 5- Estudos sobre a maior ou menor susceptibilidade do hospedeiro a infecções respiratórias causadas por A. baumannii indicaram que o microbioma do pulmão é muito importante para o potencial de virulência desta bactéria. Imagine que tem acesso a amostras de fluido pulmonar e que pode determiner o seu metagenoma. a) Qual a amostra controlo e a amostra teste? Quantas amostras seria importante analisar? (1,0 valor)

6 6 b) Para fins taxonómicos é suficiente sequenciar o gene para o rrna 16S. Este gene tem regiões conservadas em todas as bactérias e também regiões variáveis que permitem a identificação de espécies. Explique as etapas principais do procedimento experimental e o material biológico que necessita para obter informação sobre o metagenoma do fluido pulmonar. (use a tecnologia desenvolvida pela empresa Illumina, descrevendo o seu funcionamento) (1,5 valores). 6- Seleccione a resposta correcta através de um círculo (0,5 valores cada): 1- Para clonar DNA eucariótico em células procarióticas: a) Pode-se usar DNA com intrões e exões b) Tem de se usar DNA sem intrões c) Pode-se usar RNA com intrões e exões d) Os exões têm de ser removidos do DNA eucariótico 2- Quando um transposão se insere num operão, qual a possível consequência?: a) Todos os genes desse operão são eliminados b) A expressão dos genes a montante não ocorre c) A expressão dos genes a jusante não ocorre d) Os genes flanqueadores têm maior probabiblidade de recombinar 3- A principal diferença entre o vector pbr322 e o puc8 é: a) A presença de uma origem de replicação b) A presença de uma marca de resistência a um antibiótico c) A presença de locais de reconhecimento para endonucleases de restrição únicos d) A presença do gene lacz 4- Está a fazer um mapa de restrição para um plasmídeo. A restrição com EcoRI origina um fragmento com 10 kb; com XhoI origina fragmentos de 2 kb e 8 kb, e a digestão dupla gera fragmentos de 2, 3, e 5 kb. Com estes resultados, deduz que o tamanho do plasmídeo é de kb, o número de locais EcoRI é (são), o número de locais XhoI é(são), e que existe um local EcoRI dentro do fragmento XhoI de kb: a) 10; 2; 1; 8 b) 10; 1; 2; 8 c) 20; 2; 2; 8 d) 10; 1; 2; 2

7 5- Qual das seguintes misturas melhor descreve o que está presente numa reacção de PCR?: a) DNA alvo, Taq polimerase, bases marcadas com fluorescência, solução tampão b) DNA alvo, endonucleases, 4 dntps, iniciadores c) DNA alvo, Taq polimerase, 4 dntps, iniciadores d) DNA alvo, Taq polimerase, adenina, timina, citosina, guanina 7 6- Considere a sequência 3 ATGCCTGGACCCCTTAAGGTTACGTCGCGCCTAGGTATCTTGA5 e que precisa de oligonucleótidos iniciadores 10-mer para a amplificar. As sequências desses iniciadores serão: a) Fw 5 ATGCCTGGAC e Rev 5 GGTATCTTGA b) Fw 5 ATGCCTGGAC e Rev 5 TCAAGATACC c) Fw 5 TACGGACCTG e Rev 5 AGTTCTATGG d) Fw 5 ATGCCTGGAC e Rev 5 CCATAGAACT 7- Qual das etapas listadas não está envolvida na técnica FISH: a) Desnaturação do DNA alvo b) Marcação com compostos fluorescentes do DNA a usar como sonda c) Hibridação do DNA alvo com a sonda d) Extracção do DNA alvo 8- O transposão Tn5 foi introduzido em E. coli numa tentativa de identificar mutantes incapazes de crescer em lactose. Depois da electrotransformação, vai plaquear as células em meio mínimo (somente sais) suplementado com: a) Tetraciclina b) Tetraciclina e lactose c) Tetraciclina e glucose d) Lactose 9- No seguimento da experiência anterior, fez replica plating das colónias anteriormente obtidas para meio mínimo suplementado de: a) Tetraciclina b) Tetraciclina e lactose c) Tetraciclina e glucose d) Lactose e glucose 10) Quantos eventos de recombinação homóloga são necessários para integrar um plasmídeo completo num cromossoma bacteriano? a) 1 b) 2 c) 3 d) 4 11) Numa experiência de PCR, qual(ais) o(s) oligonucleótido(s) que se ligam ao DNA com a sua extremidade 3 mais próxima do centro da sequência a amplificar?: a) Somente o oligonucleótido Forward b) Somente o oligonucleótido Reverse c) Ambos os oligonucleótidos iniciadores d) Nenhum dos oligonucleótidos iniciadores 12) Fez-se uma biblioteca genómica de um organismo haplóide cujo genoma tem 3 x 10 9 pb. Se quiser clonar o equivalente a 5 genomas num vector capaz de transportar fragmentos de 20 kb, quantos clones necessita de obter?: a) 3.0 x 10 4 b) 1.5 x 10 5 c) 7.5 x 10 6 d) 7.5 x 10 5