TEÓRICA 10 DOCENTES: Prof. Helena Galvão (responsável componente teórico) Prof. Margarida Reis (componente prático)

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1 TEÓRICA 10 DOCENTES: Prof. Helena Galvão (responsável componente teórico) Prof. Margarida Reis (componente prático)

2 TAXONOMIA BACTERIANA Conceitos e Definições Conceito de espécie bacteriana é complexo. Para organismos multicelulares com reprodução sexuada a definição é uma população de indivíduos que é livre de se inter-cruzar aleatóriamente. Mas como a maioria de microrganismos reproduz-se apenas assexuadamente, é necessário estabelecer outra definição. Definição de espécie bacteriana: conjunto de estirpes que exibem um grau elevado de semelhança fenótipica e que se distinguem de outras estirpes em relação a muitos caracteres independentes. Para aplicar este conceito de espécie foi necessário desenvolver uma análise numérica ou taxonomia numérica, que foi desenvolvida no século XIX por Adanson e que calcula coeficientes de semelhança entre microrganismos. Mais tarde esta taxonomia foi aplicada a caracteres genotípicos, nomeadamente o sequenciamento de bases do 16S ARNr e de outros oligonucleótidos.

3 Taxonomia Numérica Determinação de coeficientes de semelhança Quantos géneros e espécies estão determinados? Dendrograma representando relações entre 10 estirpes bacterianas. Linhas tracejadas indicam possíveis níveis para determinar géneros (65%) e espécies (85%).

4 Caracterização genótipica Teor G+C do ADN, hibridação & sequenciamento de bases de oligonucleótidos Composição de bases do ADN : Adenina Timina com dupla ligação H Guanina Citosina com tripla ligação H Proporção molar G+C = Teor GC (%) G+C+A+T Comparação de espectros de variação no teor GC entre grupos de organismos. N.B. Eubactérias e arquiobactérias exibem maior espectro de variação na composição do ADN ou heterogeneidade genética, vertebrados têm maior homogeneidade.

5 Temperatura de fusão (Tm) do ADN (setas): ponto onde 50% de ligações H quebradas Método de determinação do teor G+C Relação linear entre Tm e teor G+C. N.B. Quanto mais rico em G & C fôr o ADN, mais termodinâmicamente estável é, devido a triplas ligações entre G & C. Relação linear entre densidade do ADN (determinada por ultra-centrifugação) e teor G+C. N.B. Diferença maior entre 2 espécies Gram (+) do que entre a galinha e o homem (?!).

6 Variação natural do teor G+C no mesmo género entre familías Teor G+C varia em espécies do género Pseudomonas de 62 a 70 %, o que constitui intervalo de variação relativamente grande. Teor G+C varia em géneros diferentes de famílias de bactérias deslizantes e de cocos Gram (+) bastante (30 40%), demonstrando heterogeneidade genética existente nestes grupos taxonómicos.

7 HIBRIDAÇÃO ADN ADN & ADN-ARNr ADN extraído de 2 estirpes diferentes de Pseudomonas aeruginosa é aquecido até desnaturação completa do ADN (desemparalhamento de filamentos); depois extractos são arrefecido e misturados para promover re-associação de filamentos. N.B. A quantidade de filamentos pares híbridos formada é proporcional à homologia no sequenciamento de bases. N.B. Autohibridação como medida de referência. Hibridação ADN- ADN com valores inferiores a ADN- ARNr porque sequência de bases mais conservada no ARNr (função activa)

8 Sequenciamento do 16S ARNr Coeficentes de semelhança Sj: < entre grupos de organismos (domínios de Woese) > no mesmo domínio N.B. Sequenciamento de oligonucleótidos (16S ARNr, 5S ARNr, ARNt) mais rápido; fragmentos são digeridos com endonucleasee específica, separados e sequenciados num sequenciador automático. Análise de homologia nas sequências alignadas de 6 nucleótidos por computador para calcular coeficientes desemelhança.

9 Dendrograma do grupo Gram (+) obtido por homologias no 16S ARNr Sub-grupo dos Actinomicetos com teor G+C elevado N.B. Género Clostridium aparece em agrupamentos diferentes com coeficientes Sj baixos (< 0.4) demonstrando hetero-geneidade genética elevada Sub-grupo com teor G+C baixo

10 Sequenciamento do 16S ARNr e novos métodos de identificação Fingerprinting : método mais rápido de sequenciamento usando transcriptase inversa viral que produz sequências de ADN complementares ao ARNr. Desta forma, sequências completas do 16S ARNr já foram obtidas para centenas de bactérias (< 500) elaborando catálogos genéticos. Sondas moleculares: segmentos curtos (14 a 40 bases) complementares ao ADN ou ARN são produzidos com endonucleases restritivas, são associadas a etiquetas fluorescentes/luminescentes ou radioactivas por reações químicas. Estas sondas depois ligam-se a sequências específicas do ácido nucleico alvo para identicação rápida (ex: bactérias patogénicas ou tóxicas em populações mistas de microrganismos). Métodos imunológicos usando anticorpos fluorescentes foram aplicados para enumerar espécies bacterianas (ex: bactérias nitrificantes) em amostras de água do mar.

11 Filogenia procariótica usando sondas moleculares Sondas moleculares identificam grupos hierarquicos diferentes (domínios Archaea & Eubactéria; grupo Gram (+); sub-grupo com teor G+C alto; sub-grupo Cytophaga - Flavobacterium & Bacteroides; sub-divisões de proteobactérias)