Aula experimental 1: Reação da polimerase em cadeia (PCR), digestão, ligação e eletroforese em gel de agarose

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1 Bloco 1 Professor: Renato Carvalho Monitora: Luana Fé UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIENCIAS DA SAÚDE FACULDADE DE FARMÁCIA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA Aula experimental 1: Reação da polimerase em cadeia (PCR), digestão, ligação e eletroforese em gel de agarose Teorias A técnica de PCR A técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction) proporciona a obtenção de um grande número de cópias de DNA a partir da amplificação exponencial de uma única molécula de DNA molde. A reação se baseia na reprodução in vitro do sistema in vivo de replicação. Assim, a PCR necessita dos seguintes reagentes: 1) Uma amostra de DNA para atuar como molde. Em concentrações elevadas a reação pode incorrer em um resultado falso negativo, com anelamento indiscriminado. Em concentrações abaixo do necessário pode haver redução da quantidade de produto amplificado; 2) Uma enzima com atividade polimerásica termoestável para sintetizar as novas fitas de DNA; 3) Um par de iniciadores (primers), isto é, sequências de oligonucleotídeos de fita simples. Essas sequências se anelam (idealmente) a uma única sequência-alvo e atuam como pontos de partida para a reação de síntese de DNA, uma vez que as DNA polimerases necessitam da existência prévia de uma sequência de nucleotídeos para iniciar a replicação; 4) Desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dntps). Estes apresentam a desoxirribose como pentose (açúcar de 5 carbonos que apresenta um átomo de hidrogênio como substituinte da hidroxila ligada ao C2), três grupamentos fosfato (PO4-3 ) e uma das quatro bases nitrogenadas encontradas no DNA, isto é, adenina, citosina, timina e guanina, sendo denominados respectivamente de datp, dctp, dttp e dgtp. A figura 1 representa dois nucleotídeos, respectivamente datp (a) e dgtp (b). a) b) Figura 1: Exemplos de nucleotídeos: a) datp e b) dgtp. Fonte: C. G., Villela, Biologia Molecular Básica, Módulo I Básico, Aula 2, Fundação CECIERJ/CEDERJ. Disponível em: Acesso em 24 de abril de 2016 às 22 horas. Os dntps formam um complexo equimolar com o Mg +2, de modo que alterações na concentração daquele reagente podem afetar o complexo. Se a concentração de dntps for além da necessária, a concentração de magnésio livre no meio reacional é reduzida, gerando pouco produto. Por outro lado, se a concentração de dntps for abaixo da necessária, a concentração de Mg +2 livre aumenta, elevando a taxa enzimática de erro de replicação;

2 5) Mg +2, que pode vir na forma de MgCl2. O cátion Mg +2 deve estar na sua forma livre para atuar como cofator enzimático, além de formar o complexo equimolar com os dntps. Se a concentração do íon for insuficiente, é possível que a concentração do produto seja pequena ou inexistente, enquanto que se a concentração do íon for excessiva, é possível que haja elevação da taxa de erro da enzima; 6) Tampão, para garantir as condições ótimas de ph para a atuação da enzima polimerásica; 7) Água (qsp). OBS.: Em alguns casos, para facilitar o procedimento, o Mg +2 pode ser comercialmente adicionado ao tampão, resultando em um mix. A PCR ocorre em cinco etapas determinadas pela variação de temperatura em um termociclador. Primeiramente, há a ativação da enzima polimerásica, seguida por ciclos de desnaturação, anelamento e extensão das cadeias de DNA. Assim, na etapa de desnaturação há o rompimento das ligações de hidrogênio entre s fitas moldes de DNA; na etapa de anelamento há a ligação, por complementaridade, dos primers às fitas abertas; e na extensão há a síntese de DNA pela inserção de dntps na molécula em formação na porção 3` OH dos primers. Assim, a DNA polimerase inicia a replicação na extremidade 3 OH do primer e copia a fita oposta. Na última etapa há uma segunda extensão para finalizar quaisquer eventuais fitas que não tenham sido completamente amplificadas (Andrade, 2011; Lima, 2008). A figura 2 ilustra as etapas da PCR. Figura 2: Etapas do ciclo de PCR: desnaturação, anelamento e extensão. Adaptado de Polymerase Chain Reaction (PCR), NCBI. Disponível em: < Acessado em 02/11/2015 às 18h58. Iniciadores (primers) Definição Os iniciadores ou primers correspondem a sequências de oligonucleotídeos, ou seja, sequências curtas de ácido nucleico, de fita simples. Essas sequências atuam como pontos de partida para a reação de síntese de DNA, uma vez que as enzimas DNA polimerases necessitam da existência prévia de uma fileira de nucleotídeos para que possam adicionar. Os primers possuem aplicação tanto in vivo quanto in vitro. In vivo os primers são fitas de RNA sintetizadas pela enzima primase, um tipo de RNA polimerase, previamente ao processo de replicação. Por outro lado, os primers também podem ser utilizados na técnica de PCR, durante a qual há a amplificação in vitro do número de cópias de um fragmento específico (no caso de primers específicos, próprios para determinada região) da molécula de DNA. Assim, a reação permite a obtenção de uma quantidade de material genético suficiente para as análises da sequência desejada a partir de uma sequência-alvo em pequenas concentrações. Os primers se ligam por complementaridade às fitas de DNA, de modo que há o primer senso e o antissenso, também chamados respectivamente de forward (Fw) e reverse (Rv). Os primers são convencionalmente escritos no sentido 5` para 3`. Construção

3 Dentre as características ideais que devem ser consideradas durante a construção do par de primers estão: 1) Complementaridade à sequência-alvo, contida na molécula de DNA-molde, de modo que os primers devem se anelar a uma única região genômica. Contudo, eles não precisam ser completamente homólogos às fitas de DNA-molde, contanto que a porção 3` OH de cada primer possa estar ancorada à respectiva fita do DNA-molde. A importância da ancoragem da porção 3` OH se deve ao fato de ser justamente a ponta à qual a DNA polimerase se ligará para iniciar a síntese de DNA; 2) Não-complementaridade entre os primers. Isso deve ser feito para que não haja anelamento primerprimer, ao invés de primer-dna molde; 3) A temperatura de fusão de um primer deve ser próxima da do outro; 4) Não-formação de estruturas secundárias, como hairpins ou grampos, conforme mostrado na figura 3: Figura 3: Exemplo de hairpins ou grampos. Fonte: Adaptado da aula de Biologia Molecular Aplicada ministrada pelo professor André Araújo na UFRJ em ) Variação de tamanho de 15 a 30 pares de base (pb); 6) Presença de conteúdo guanina (G) citosina (C) em torno de 50%; 7) Ajuste de códons. Se for desejado posteriormente incluir a sequência-alvo em um plasmídeo, deve-se avaliar se a clivagem pelas enzimas de restrição escolhidas gera uma quebra na sequência de trincas na qual são organizados os códons. Caso isso ocorra, deve-se inserir no primer Fw tantos nucleotídeos a mais quanto necessários para reajustar a distribuição de códons e garantir a correta expressão da proteína desejada; 8) As sequências de clivagem das enzimas de restrição, ou seja, os sítios de restrição, devem estar contidas na porção 5` dos primers, caso seja desejado inserir posteriormente a sequência amplificada em um vetor de expressão. Os sítios de restrição não devem estar inseridos na porção 3` OH dos primers justamente para preservar a ponta de ligação da DNA polimerase e a ocorrência da replicação. Por outro lado, os sítios de clivagem das enzimas de restrição escolhidas não podem estar contidos no interior da sequência-alvo, para não fragmentá-la e evitar-se, assim, a geração de uma proteína disfuncional e/ou incompleta. O primer Fw ou senso deve ser complementar à fita 3` - 5`, ou seja, à fita antissenso. Já o primer Rv ou antissenso deve ser complementar à fita 5` - 3`, ou seja, à fita senso. A figura 4 mostra a construção de primers (a) e a sua atuação (b): a)

4 b) Figura 4: Primers: a) construção e b) atuação. Outras observações 1) As temperaturas de anelamento devem ser estabelecidas com base na temperatura de desnaturação (TM) dos primers e do conteúdo de G e C da sequência-alvo; 2) O tempo de extensão deve ser determinado pelo tamanho do fragmento a ser amplificado. A técnica de eletroforese Na técnica de eletroforese as amostras são aplicadas em uma das extremidades de um gel de natureza porosa e, sob a ação de uma diferença de potencial elétrico, migram através dos poros em direção à outra extremidade. Essa migração é diferencial, pois as moléculas de menor massa atravessam a rede do gel rapidamente, enquanto que as de maior massa, lentamente. Devido à natureza aniônica do DNA conferida pelos grupamentos fosfato, esse ácido nucleico migra do polo negativo para o positivo. Os fragmentos formam bandas no gel correspondentes aos seus tamanhos e, após coloração do mesmo com brometo de etídio, por exemplo, o perfil de bandas pode ser visualizado com o auxílio de um transiluminador de luz ultravioleta (UV). A matriz porosa pode ser de poliacrilamida ou de agarose, conforme o tamanho dos fragmentos que se deseja separar. Além disso, o tamanho dos poros pode variar segundo a concentração dos polímeros, influenciando a eficiência da separação. Isso ocorre porque em uma rede de poros menores a migração

5 molecular é dificultada e cada molécula interage por maior tempo com os poros. Consequentemente, A utilização de um padrão ou marcador de peso molecular distribuído comercialmente e também aplicado no gel antes do início da corrida permite a confirmação do tamanho do fragmento amplificado, ou seja, aquele de interesse, através da comparação entre o peso molecular do próprio fragmento e a disposição de bandas do padrão (Lima, 2008). A figura 5 corresponde a um exemplo de perfil de corrida eletroforética em gel de agarose Figura 5: Exemplo de perfil de corrida eletroforética em gel de agarose. No espaço referente ao primeiro poço (slot) pode ser observado o padrão de peso molecular (de venda comercial), onde cada banda apresenta ao lado o seu respectivo peso molecular; e nos espaços correspondentes aos demais poços estão as amostras 1, 2, 3 e 4. Os menores fragmentos, ou seja, aqueles de menor peso molecular, migram mais facilmente através da matriz do gel, se colocando mais à frente no gel. A técnica de digestão molecular A técnica de digestão molecular se baseia na clivagem enzimática de sequências de DNA. In vivo esse procedimento é realizado como, por exemplo, forma de proteção bacteriana contra fagos. As enzimas utilizadas na técnica de digestão molecular são chamadas de endonucleases de restrição, ou simplesmente enzimas de restrição, pois reconhecem e clivam ligações fosfodiéster em sítios específicos presentes no interior das moléculas de DNA. Em consequência, podem ser geradas extremidades na fita de DNA com pontas cegas ou com pontas coesivas ou adesivas, respectivamente extremidades simétricas e assimétricas. Entretanto, cadeias com extremidades coesivas têm maior facilidade de ligação a cadeias com sequências complementares. A figura 6 ilustra os tipos de extremidades que podem ser originadas: a) extremidade cega e b) extremidade coesiva. a) b) Figura 6: Tipos de extremidades (pontas) que podem ser geradas após a clivagem de uma molécula com uma enzima de restrição: a) pontas cegas ou simétricas e b) pontas assimétricas, adesivas ou coesivas. Fonte: Stoco, P; e Grisard, E. C., Clonagem Molecular, Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biociências. A técnica de ligação molecular As DNA ligases realizam a reparação de descontinuidades em fitas de DNA em processos replicativos, caracterizadas in vivo pelos Fragmentos de Okasaki. Essas enzimas refazem as ligações fosfodiéster (OH + PO4-3 ) da molécula de DNA à medida que interagem com a fita-molde no sentido 3` para 5` e realizam a reparação da fita em síntese também no sentido 3` para 5. A reação ainda é catalisada por ATP. As figuras 7 e 8 ilustram a atuação da DNA ligase.

6 Figura 7: Atuação da DNA ligase. Fonte: Adaptado da aula de Biologia Molecular Aplicada ministrada pelo professor André Araújo na UFRJ em Figura 8: Atuação da DNA ligase: reparação das ligações fosfodiéster presentes na molécula de DNA. A técnica de clonagem molecular

7 A técnica de clonagem molecular, também denominada de tecnologia do DNA recombinante, consiste na manipulação de moléculas de DNA de diferentes origens para geração de uma construção única. Esta pode ser inserida em hospedeiros apropriados, como bactérias, gerando diversos clones, de modo que cada colônia bacteriana corresponde a um clone da sequência recombinada. Após a seleção do clone mais adequado, a construção gerada pode ser utilizada para a expressão de proteínas de interesse para a pesquisa ou para a produção de fármacos. A clonagem molecular abrange o uso de outras técnicas, como a de digestão e a de ligação. A digestão, empregada in vitro, envolve a clivagem de um fragmento de DNA de interesse, que será o inserto, e de DNA de um vetor, que pode ser um plasmídeo ou um bacteriófago, por exemplo. O inserto pode ser previamente submetido a uma PCR para aumentar o seu número de cópias. A ligação das moléculas do inserto e do vetor é feita por ligases, como a ligase do fago T4 (T4 ligase), baseada na atuação in vivo da enzima. Assim, as etapas da clonagem molecular incluem: 1) Digestão da molécula de DNA vetorial (plasmídeo ou fago) por enzimas de restrição; 2) Digestão da molécula de DNA correspondente à sequência-alvo (inserto) com a(s) mesma(s) enzima(s) de restrição usada(s) para a clivagem do vetor, de modo que essa o inserto pode ser previamente submetido à PCR para amplificação do seu número de cópias. A clonagem pode ser do tipo não-dirigida ou não-direcional, se for utilizada apenas uma enzima de restrição, ou do tipo dirigida ou direcional, em que são utilizadas duas enzimas. A vantagem da clonagem direcional é restringir a posterior recombinação das moléculas de DNA, à medida que direciona o inserto para um sentido específico, ou seja, cada flanco do inserto poderá se ligar por complementaridade a apenas um dos lados do vetor, pois o outro lado consistirá em uma ponta diferente. Isso é importante porque garante a manutenção do sentido correto da informação gênica e, consequentemente, na sequência correta da proteína produzida, caso seja desejado utilizar a construção inserto + vetor para um sistema de expressão proteica. Se for utilizada apenas uma enzima de restrição, só o acaso vai dizer se o inserto se ligará no ponto certo, conforme demonstrado na figura 9. Figura 9: Situação em que é usada apenas 1 enzima de restrição para a clivagem da sequência de DNA. As pontas coesivas (assinaladas pelo colchete) continuam sendo geradas, mas elas são palindrômicas (idênticas quando lidas no sentido inverso). Desse modo, a sequência correspondente ao inserto pode se inserir ao acaso tanto em um sentido quanto em outro, configurando uma leitura de nucleotídeos diferente e a produção de uma proteína, por exemplo, diferente da desejada. Além disso, o emprego de duas enzimas de restrição não gera pontas complementares entre si, uma vez que cada enzima de restrição possui um sítio de clivagem próprio. Este é um dos artifícios para impedir a religação do vetor, que é muito favorável; 3) Ligação do inserto no vetor pela DNA ligase; 4) Introdução da molécula de DNA recombinante no hospedeiro previamente escolhido, como uma bactéria;

8 5) Seleção e identificação dos clones recombinantes mais adequados, pois pode haver erros de ligação durante o processo, como ligações inserto-inserto e vetor-vetor, ao invés de inserto-vetor. Posteriormente, as construções podem ser empregadas em outras técnicas, como a produção de proteínas. OBS. 1: Nesta prática, apenas as etapas 1, 2 e 3 serão realizadas. Elas estão representadas na figura 10: a) b) c) d) Figura 10: Etapas da clonagem molecular: a) sítios de clivagem das enzimas de restrição 1 e 2 na molécula de vetor plasmidial; b) sítios de clivagem das enzimas de restrição 1 e 2 na molécula de DNA de inserto; c) clivagem com as enzimas de restrição e posterior recombinação com a DNA ligase; d) construção recombinante obtida. OBS. 2: Como impedir a religação do vetor usando-se apenas 1 enzima de restrição? Resposta: A DNA ligase atua nas ligações fosfodiéster (OH + PO4-3 ), então ao se retirar um dos componentes da ligação, ela não poderá atuar e, consequentemente, o vetor não se religará. As hidroxilases vão gerar produtos pouco estáveis. No entanto, a química de fosforilação é bem estabelecida. Assim, o vetor pode ser tratado com uma fosfatase. Ele pode até se reanelar, mas esta é uma condição instável, de modo que preferencialmente ele estará com as pontas livres. OBS. 3: Nesse caso, de onde virá o fosfato necessário à atuação da DNA ligase? Resposta: O fosfato necessário à ligação virá do inserto, que não deve ser tratado com a fosfatase. OBS. 4: Mas como garantir que o inserto não sofrerá também a ação da fosfatase? Resposta: Fazer as reações competentes ao vetor e as competentes ao inserto em tubos diferentes. OBS. 5: O fato de não haver o grupo fosfato no vetor pode gerar, mesmo após a recombinação, uma lacuna na construção. Isso não pode ser prejudicial ao sistema? Resposta: Não, pois a lacuna se fechará quando a bactéria começar a se replicar. Dessa forma, as sequências seguintes serão normais. OBS. 6: Se forem usadas 2 enzimas de restrição, atentar ao fato de não escolher aquelas que formam pontas cegas. Referências bibliográficas

9 ANDRADE, P. Portal: Ano: Aula de Biologia Molecular Aplicada ministrada pelo professor André Araújo na UFRJ em LIMA, L. M. de. Conceitos Básicos de Técnicas em Biologia Molecular. Documentos 191 EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária). Campina Grande, Paraíba Polymerase Chain Reaction (PCR), NCBI. Disponível em: < Acessado em 02/11/2015 às 18h58. Primer definition. Scitable by Nature Education. Disponível em: Acesso em: 18 de abril de 2016 às 22h. STOCO, P; e GRISARD, E. C., Clonagem Molecular, Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biociências. VILLELA, C. G., Biologia Molecular Básica, Módulo I Básico, Aula 2, Fundação CECIERJ/CEDERJ. Disponível em: Acesso em 24 de abril de 2016 às 22 horas.

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