Clonagem de genes e fragmentos de DNA de interesse

Transcrição

1 Clonagem de genes a e fragmentos de DNA de interesse

2 Clonagem Produzir cópias de uma molécula de DNA Criação de uma molécula recombinante e sua propagação

3 Definições Clonar : fazer cópias idênticas Isolamento de uma célula a partir de uma população maior, permitindo então sua reprodução de forma assexuada, para gerar muitas células geneticamente idênticas; Tecnologia de DNA recombinante: o uso de procedimentos de manipulação de DNA para produzir múltiplas cópias de um simples gene ou de um segmento de DNA;

4 Clonagem Restrição Enzimática

5 Clonagem Restrição Enzimática

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7 Clonagem Complementariedade entre os finais gerados pela enzima de restrição

8 Fazer uma molécula de DNA recombinante Para quê?

9 Fazer uma molécula de DNA recombinante Para quê? Propagação de um DNA de interesse

10 Fazer uma molécula de DNA recombinante Para quê? Produção de um produto de interesse Ex. insulina Outras aplicações: Estudar genes do desenvolvimento, genes relacionados a doenças...etc.

11 Fazer uma molécula de DNA recombinante Planta de tabaco produzindo luciferina Para quê? Transgênicos

12 Fazer uma molécula de DNA recombinante Para quê? Transgênicos

13 Aplicações da tecnologia do DNA recombinante Animal transgênico produzindo proteína de interesse no leite (Ativador de Plasminogênio tecidual)

14 Clonagem 1. Criação de uma molécula recombinante (vetor de propagação + gene/dna de interesse) 2. Inserção do vetor recombinante em uma célula hospedeira 3. Seleção das células recombinantes

15 Vetores de clonagem Plasmídio - molécula de DNA extracromossômica circular que se replica dentro da célula bacteriana limite de clonagem: 100 to pares de bases

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21 Vetores de clonagem Fago Clonagem de fragmentos de DNA de até 20 kb

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23 Vetores de clonagem Cosmídio - molécula de DNA extracromossômica circular que possui características de plasmídeos e de fagos limite de clonagem: kb

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27 Vetores de clonagem BAC (Bacterial Artificial Chromosome) - cromossomo artificial baseado em plasmídeos bacterianos limite de clonagem: kb

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29 Vetores de clonagem YAC (Yeast Artificial Chromosome) - cromossomo artificial que contém telômeros, origem de replicação, centrômero e um marcador para sua identificação em células de levedura limite de clonagem: kb

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31 Vetores de expressão

32 Inserção de vetores recombinantes em uma células hospedeiras Transformação - a célula hospedeira é tornada competente para o vetor de clonagem ser introduzido Transfecção - quando o vetor de clonagem tem características de vírus, a célula hospedeira pode ser transfectada para inserir a molécula recombinante Microprojéteis - partículas cobertas com DNA são projetadas contra uma célula e penetram em sua membrana Eletroporação - a célula é submetida a um campo elétrico que faz com que pequenos poros sejam abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido

33 Criação de uma molécula recombinante DNA (produto de digestão ou PCR) Plasmídeo (pbs, puc, pgem)

34 Ligação - a molécula de DNA purificado é ligada a um vetor de clonagem (plasmídeo, fago, cosmídeo, BAC, YAC) DNA (produto de digestão ou PCR) Plasmídeo (pbs, puc, pgem)

35 Plasmídios como vetores de clonagem Transformação - o DNA inserido no plasmídio é introduzido dentro de uma célula hospedeira apropriada (bactérias competentes) DNA (produto de digestão ou PCR) Cromossomo bacteriano Plasmídeo Célula bacteriana Isolamento dos plasmídeos recombinantes

36 Plasmídios como vetores de clonagem Bactérias competentes + vetores recombinantes submetidos a um choque térmico (estimula a inserção do plasmídeo na bactéria competente hospedeira) recombinant plasmid E.coli host cell transformed cell

37 Plasmídios como vetores de clonagem Transformação e propagação de vetores recombinantes

38 Confirmação da transformação Crescimento em meio seletivo contendo antibiótico Análise de restrição de DNA plasmidial PCR direto da colônia Hibridização com uma sonda específica Sequenciamento do DNA plasmidial

39 Seleção das células recombinantes: presença de inserto no plasmídio overnight growth white colonies vector + insert blue colonies vector ampicilin-resistance colonies

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41 Verificar presença de recombinantes - digestão enzimática

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43 Criação de uma molécula recombinante DNA (produto de digestão ou PCR) Plasmídeo (pbs, puc, pgem)

44 Criação de uma molécula recombinante

45 Criação de uma molécula recombinante

46 Bibliotecas: Genômica e de DNA (produto de digestão ou PCR) cdna Plasmídeo (pbs, puc, pgem)

47 Construção de bibliotecas de DNA DNA genômico pode ser adquirida comercialmente ou de outros laboratórios gera um número muito grande de clones (fragmentos randomicos) ~ restrição parcial - fragmentos muito largos são difíceis de serem clonados ou amplificados por PCR bibliotecas subgenômicas vetores fago lambda, YAC, BAC

48 Construção de bibliotecas de cdna Isolamento da fração de RNAm de um certo tecido em uma determinada condição Conversão a cdna pela ação da transcriptase reversa Clonagem em vetor apropriado Propagação em bactéria Seleção dos clones de interesse (screening)

49 Isolando o DNA de interesse A partir de uma biblioteca genômica A partir de uma biblioteca de cdna seleção direta PCR - primers

50 Seleção dos clones de interesse Screening Imunológico: detecção da proteína expressa sonda de DNA: informações incompletas ou obtidas a partir de bancos de DNA oligonucleotidio produto de PCR clone incompleto

51 Sondas de DNA Produto de PCR oligonucleotídio sintético fragmento de restrição de DNA clone de cdna sonda de RNA a partir de transcrição in vitro São utilizadas em: screening de bibliotecas southern blotting northern blotting dot blotting

52 Desenho de sondas a partir da sequência de aminoácidos de uma proteína N-Gly - Leu - Pro - Trp - Glu - Asp - Met - Trp -Phe - Val - Arg-C GGA TTA CCA TGG GAA GAC ATG TGG TTC GTA AGA GGC TTG CCC GAG GAT TTT GTC AGG GGT CTA CCT GTT CGA GGG CTC CCG GTG CGC CTT CGT CTG CGG Região de degeneração mínima Sonda sintética TGG GAA GAC ATG TGG TTC GT G T T

53 Seleção de uma biblioteca Hibridização com sondas de oligonucleotídios marcadas A sequência do DNA de interesse hibridiza a uma sonda marcada. Influência de Tm Seleção com anticorpos Expressão de uma proteína que pode ser reconhecida por um anticorpo

54 Seleção de uma biblioteca DNA genômico: cerca de clones precisam ser analisados para se localizar uma sequência gênica. cdna: se for feita de um tecido que expressa fortemente aquele gene, as chances de encontrar o clone correto são maiores. 1 em 20 até poli(a)+ RNA

55 Seleção de uma biblioteca Amplificação da biblioteca na célula hospedeira Transferência para uma membrana de nitrocelulose Desnaturação e neutralização. Cross-linking Hibridização. Lavagens para retirada da sonda não ligada Revelação e isolamento dos clones

56 Southern Blotting

57 Southern blot

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62 Vetor de expressão Análise do produto

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