DNA r ecomb m i b n i a n nt n e

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1 Tecnologia do DNA recombinante DNA recombinante molécula de DNA contendo sequências derivadas de mais de uma fonte.

2 As primeiras moléculas de DNA recombinante 1972 Paul Berg : vírus SV40 + plasmídeo 1973: Stanley Cohen e Annie Chang mostraram que a molécula de DNA recombinante pode ser mantida e replicada dentro da E. coli. Plasmídeos: psc101(tetraciclina) + psc102 (Kanamicina) = cortados com EcoRI, misturados e religados com DNA ligase. O plasmídeo resultante foi introduzido dentro de células de E. coli e semeadas em placas com ambos antibióticos. A presença de colônias indicou que o plasmídeo recombinante tinha sido incorporado pela bactéria.

3 Alguns objetivos que a tecnologia do DNA recombinante tornou possível Isolar um gene em particular, parte de um gene ou uma região do genoma; Produzir a molécula de proteína de interesse em larga escala; Aumentar a eficiência da produção de enzimas e drogas para comercialização; Modificar organismos existentes para que eles expressem uma característica de interesse que não seja codificada pelo genoma; Corrigir defeitos genéticos em organismos complexos, inclusive humanos.

4 Principais conceitos e definições usados na tecnologia do DNA recombinante DNA recombinante é feito pela separação de um fragmento de DNA de interesse e sua ligação em uma molécula de DNA pequena de replicação rápida. DNA de interesse + = Molécula pequena Molécula de DNA recombinante

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6 Como conseguir o pedaço de DNA que você quer replicar e estudar? Organismo do qual o DNA de interesse é extraído = doador; O DNA no qual o DNA de interesse é inserido = vetor; Para cortar o DNA do organismo de interesse utiliza-se = enzimas de restrição; A molécula do vetor que possui o fragmento de DNA estranho = molécula de DNA recombinante;

7 Os vetores são misturados com bactérias para a incorporação e replicação = processo de transformação; Isolando as bactérias que carregam o vetor recombinante você poderá multiplicar o fragmento de interesse que será = clone de DNA; Uma vez que você tenha uma grande quantidade do DNA clonado você pode caracterizar o DNA (sequenciando, estudando função, etc.), modificar e re- inserir num organismo.

8 Ferramentas moleculares Utilizadas na tecnologia do DNA recombinante

9 Enzimas de restrição: produzidas pelas bactérias para proteção contra infecção causada pelo DNA viral. Existem + de enzimas de restrição conhecidas.

10 Sítio de reconhecimento da Enzima de restrição As enzimas de restrição cortam seqüências específicas através do reconhecimento de seqüências palindrômicas do DNA, que aparecem espalhadas no genoma de todos os organismo.

11 As enzimas reconhecem 4, 6 ou 8 (ex. 8 de base. (ex. 8 Not I) pares A maioria das enzimas de restrição são específicas para sítios únicos de restrição. Os sítios de restrição são reconhecidos independente da fonte do DNA Um fragmento de DNA produzido produzido por um par de cortes adjacentes é chamado de FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO.

12 Ação da enzima: As enzimas de restrição geram: Extremidades sem ponta - blunt ends Extremidades coesivas, colantes - sticky ends As extremidades coesivas apresentam: 5 saliente 3 saliente Blunt ends Sticky ends 5 CCGAT ATCTA 3 5 ATGGATCCTC 3 3 GGCTA TAGAT 5 3 TACCTAGGAT 5

13 Extremidades sem pontas Extremidades coesivas

14 Alguns exemplos de enzimas de restrição: BamHI Bacillus amyloliquefaciens GGATCC CCTAGG HindIII Haemophilus influenzae Rd AAGCTT TTCGAA Ambas geram extremidades 5 - sticky

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16 Característica dos nomes das enzimas de restrição: EcoRI E = gênero Escherichia co = espécie coli R = linhagem RY13 I = primeira endonuclease isolada

17 Vetores de clonagem Vetores de clonagem são moléculas de DNA que são usadas para transportar as seqüências de DNA de interesse para os hospedeiros biológicos e para o tubo na bancada do laboratório. Exemplo: da célula bacteriana para o tubo para a célula de uma planta.

18 Todos os vetores de clonagem compartilham 4 propriedades em comum: 1. Contêm um marcador genético para seleção. 2. Habilidade de promover replicação autônoma 3. Contêm sítios de restrição únicos para facilitar a clonagem do inserto de DNA. 4. Apresentam uma quantidade mínima de DNA não-essencial para otimizar a clonagem.

19 Para clonagem em bactérias: Vetores para clonagem de genes em hospedeiros bacterianos são: Plasmídeos Fagos Híbridos de plasmídeo + fago = cosmídeo BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

20 PLASMÍDEOS

21 Características essenciais: Origem de replicação ori para replicação no hospedeiro bacteriano; Sítios únicos de restrição para inserção do DNA que será clonado; Marcador de seleção (gene de resistência à antibióticos: tet tetraciclina, amp ampicilina). Exemplos: pbr322, puc18. Tamanho limitado de inserto de DNA = fragmentos menores que 20 Kb. Úteis para clonagem de genomas pequenos ou subclonagem de genes específicos.

22 Vetores virais de células bacterianas: Exemplo de vetores virais bacterianos: fago lambda (λ), bacteriófago M13. O fragmento de interesse é incorporado ao genoma de um vírus. Como o vírus infecta as células com alta eficiência o gene clonado pode ser introduzido na célula hospedeira com mais eficiência do que a transformação.

23 Fago lambda: permite a inserção de fragmentos de até 25 Kb

24 Cosmídeos: híbridos entre plasmídeos e fagos Permite a inserção de fragmentos grandes (40-50 kb) dentro de 1 cabeça de fago. Infecta o hospedeiro E. coli mas se replica como um plasmídeo.

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26 BACs (Bacterial Artificial Chromosome) Carregam fragmentos de até 300 Kb. Podem ser isolados e Podem ser isolados e manipulados como plasmídios.

27 Vetores virais de células eucariontes: retrovírus podem efetuar a integração estável de DNA clonado em células de mamíferos, permitindo a expressão terapia gênica.

28 Vetores eucarióticos: Se você precisa estudar a função do genoma eucarionte in vivo, a única maneira de fazer isso é trabalhar com células eucariontes. Se você precisa manipular genes eucarióticos por razões médicas e econômicas usar vetores eucarióticos. Exemplos de vetores eucarióticos: Yeast Artificial Chromosome YAC podem carregar pedaços muito grandes de DNA para ser inserido me células eucariontes até 800 Kb (cosmídeos até 50 Kb, BAC até 300 Kb)

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30 Vetores específicos para plantas: A bactéria do solo Agrobacterium tumefaciens causa tumores nas plantas (gralhas). O agente causador do tumor é: o plasmídeo Ti que transforma a célula normal da planta em uma célula cancerosa quando ele é integrado no DNA da planta. Geneticistas podem inserir DNA estranho dentro deste plasmídeo e inserir novos genes no genoma da planta.

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32 Estratégias para clonagem em plasmídeo: Uma típica clonagem em plasmídeo envolve 5 passos: 1. Digestão com enzima de restrição da amostra de DNA; 2. Digestão com enzima de restrição do plasmídeo que será utilizado como vetor; 3. Ligação dos produtos da amostra de DNA e do vetor plasmídeo; 4. Transformação da bactéria hospedeira (E. coli) com os produtos da ligação; 5. Crescimento da bactéria transformada nas placas de Agar com a seleção para a resistência ao antibiótico.

33 Passo 1. Digestão com Enzima de restrição da amostra de DNA.

34 Passo 2. Digestão do vetor plasmídeo com enzima de restrição

35 Passo 3. Ligação dos produtos digeridos da amostra de DNA com o vetor plasmídeo

36 Passo 4. Transformação do hospedeiro bacteriano (E. coli K-12) com os produtos de ligação. O processo de transferência de DNA exógeno para dentro das células do hospedeiro é chamado transformação ; E se refere para qualquer aplicação em engenharia genética na qual DNA purificado é ativamente ou passivamente importado para dentro das células hospedeiras usando métodos não-virais (não naturais) Há basicamente dois métodos para a transformação de bactérias:

37 Método de transformação química utilizando cloreto de cálcio CaCl2 e choque de temperatura

38 Eletroporação: baseado num curto pulso de carga elétrica para facilitar a entrada do DNA.

39 Passo 5. Crescimento nas placas (Amp+X-Gal) de Agar e seleção das colônias resistentes ao antibiótico Colônias azuis representam bactéria Ampicilina-resistente que contêm o vetor plasmídeo e expressa o fragmento alfa da seqüência codificante LacZ intacta. Colônias brancas representam bactérias Ampicilina-resistente que contêm plasmídeo + inserto e não produz o fragmento LacZ.

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