III. Tecnologia do DNA Recombinante BIOTECNOLOGIA. Uso de organismos vivos ou parte deles para a produção de bens e serviços

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1 III. Tecnologia do DNA Recombinante BITECNLGIA Uso de organismos vivos ou parte deles para a produção de bens e serviços 1

2 Agricultura Meio ambiente Medicina Cultura de Células e Tecidos Bioprocessamento INSTRUMENTS BITECNLÓGICS Tecnologia de fermentações Engenharia de Proteínas Engenharia Genética Tecnologia de Chip de DNA Tecnologia de Biosensores Engenharia de tecidos Microbiologia Ciência dos Materiais Bioquímica CNHECIMENT CIENTÍFIC Biologia Molecular Engenharia Química Fisiologia Genética Computação Tecnologia do DNA Recombinante (Engenharia Genética) Conjunto de técnicas envolvidas na construção, estudo e utilização de moléculas de DNA recombinantes 2

3 Utilização do DNA Recombinante Estudos de replicação e expressão gênica Sequenciamento de ácidos nucléicos Produção de proteínas heterólogas Investigação de cruzamentos e crimes Diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas Requisitos para btenção de Moléculas de DNA Recombinante a) Enzimas para manipulação de ácidos nucléicos b) Veículos para clonagem gênica c) Introdução do DNA de interesse em célula hospedeira 3

4 a) Enzimas para Manipulação de Ácidos Nucléicos Classificação: Nucleases Ligases Polimerases Enzimas modificadoras Topoisomerases Nucleases Enzimas que rompem as ligações fosfo-diésteres que unem nucleotídeos adjacentes em uma fita de ácido nucleico Classificação: - Exonucleases = removem um nucletídeo a cada vez, a partir de uma extrem. da moléc. - Endonucleases = capazes de quebrar ligações fosfodiéster no interior da molécula de DNA 4

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6 Endonucleases de Restrição São enzimas que têm a capacidade de reconhecer e cortar moléculas de DNA em posições específicas 6

7 Tipos de Enzimas de Restrição # Tipo I - Sequência de reconhecimento assimétrica - Hidrólise não específica e ocorre a pb - Precisa de ATP # Tipo III - Sequência de reconhecimento assimétrica (5-7pb) - Local de hidrólise a 24 a 26 pb - Precisa de ATP # Tipo II Tipos de Enzimas de Restrição - Sequência de reconhecimento é palindrômica - Não precisa de ATP e apenas Mg++ 7

8 Tipos de Clivagem Eixo de Simetria Ao redor do Eixo de Simetria NMENCLATURA nome dado a enzima refere-se ao organismo de onde foi isolado. A primeira letra representa o gênero e as outras duas a espécie, seguido de um algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual foi isolado. Sítios de reconhecimento, modificação e clivagem por algumas enzimas de restrição Enzima Local de restrição rganismo de origem EcoRI Escherichia coli EcoRI HindIII Smal Gênero Espécie rdem da descoberta Haemophilus influenza Serratia marcescens 8

9 Nomenclatura Frequência de Corte com Enzimas de Restrição - Seqüência tetranucleotídica (GATC) 4 x 4 x 4 x 4 = 256 nucleotídeos - Seqüência hexanucleotídica (GGATCC) 4 x 4 x 4 x 4 x 4 x 4 = nucleotídeos 9

10 DNA ligases Enzimas com capacidade de reparar quebras em fitas individuais em moléculas de DNA fita dupla durante a replicação Tipos de fragmentos de DNA reparados: Fragmentos com extremidades abruptas Fragmentos com extremidades coesivas 10

11 DNA ligases Polimerases Enzimas que sintetizam uma fita de DNA, complementar a uma molécula de DNA ou RNA preexistente Exemplos: DNA polimerase I (atividade de polimerase e nuclease) Fragmento de Klenow (atividade de polimerase) Taq polimerase Transcriptase reversa 11

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14 Enzimas Modificadoras de DNA - Fosfatase alcalina = remove o grupamento fosfato presente na extremidade 5 de uma molécula de DNA Enzimas Modificadoras de DNA - Fosfonucleotídeo-quinase = adiciona o grupo fosfato na extremidade 5 de uma molécula de DNA 14

15 Enzimas Modificadoras de DNA - Desoxinucleotidil-transferase terminal = adiciona 1 ou + desoxirribonucleotídeos a extremidade 3 de uma molécula de DNA Topoisomerases Enzimas que tem a capacidade de modificar a conformação do DNA por meio da introdução ou remoção super enrolamentos. 15

16 b) Veículos para Clonagem Gênica Plasmídeo Fago Lambda Cosmídeo Fagomídeo Cromossomo Artificial de Levedura (YAC) Cromossomo Artificial de Bactéria (BAC) Cromossomo Artifical Humana (HAC) Plasmídeo Pequena molécula de DNA circular capaz de se replicar independentemente do DNA cromossômico Cromossomo Plasmídeo Cromossomo Plasmídeos Bactéria Bactéria 16

17 Tamanho de Alguns Plasmídeos Estratégias de Replicação 17

18 Grupos de Plasmídeos: Conjugativos ou não Conjugativos Características Básicas dos Plasmídeos rigem de replicação Sítios de restrição Presença de genes de seleção 18

19 Características Básicas dos Plasmídeos ori ori 19

20 Clonagem Molecular Processo de construção de moléculas de DNA recombinante e da sua multiplicação em hospedeiros apropriados que possibilitam a seleção do DNA recombinante Etapas da Clonagem Molecular 20

21 Clonagem molecular 1. Um gene específico 2. Genoma-Bibliotecas 21

22 Plasmídeos (insertos 15 Kb) Métodos de Introdução do DNA no Hospedeiro Transformação bacteriana Microinjeção Biobalística Infecção viral Eletroporação 22

23 Métodos de Introdução do DNA no Hospedeiro Inserção do vetor no hospedeiro Transformação por choque térmico: -Imersão das células numa solução de CaCl 2 a 0ºC -Aquecimento a 42ºC -Permeabilização da membrana em condições de alta temperatura, permitindo a passagem do vetor Vetor Inserto DNA recombinante E. coli transformada com vetor 23

24 Preparo de Células Competentes Transformação Bacteriana Marcadores de seleção (Azul-Branco): gene de resistência à ampicilina operon lac - gene lac Z codifica para a β-galactosidase 24

25 Métodos de Seleção de Clones Recombinantes Seleção indireta Inativação de genes de resistência a antibióticos Seleção direta Gene lacz seleção pela cor Marcador de seleção peron lac produção de β-galactosidase Na natureza β-galactosidase Na placa (com X-gal) 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-galactopyranoside β-galactosidase Reação de cor azul Cor Branca 25

26 Interpretação do resultado Principais Métodos de Identificação de Clones Recombinantes Análise do Padrão de Restrição Hibridação de ácidos nucléicos Reação da polimerase em cadeia (PCR) 26

27 utros Vetores de Clonagem Fagos Tipo de vírus com capacidade de infectar bactérias 27

28 Padrão Geral de Infecção de um Fago Ciclo de Infecção Lisogênica do Fago Lambda 28

29 Genes do Fago Lambda (49 kb) 29

30 Clonagem em um vetor λ 30

31 Cosmídios (insertos 44 Kb) 31

32 Fagomídios (insertos 23 Kb) BAC (insertos 300 Kb) 32

33 YAC (insertos 2 Mb) ARS:Seqüência de replicação autônoma CEN:Seqüências centroméricas Possuem seqüências de DNA específicas de levedura: telômero, centrômero e origem de replicação Vetores de clonagem: número de cópias 33

34 Desenvolvimento de Tecnologias Básicas Extração e Purificação de Ácidos Nucléicos Eletroforese em gel Hibridização Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) Vetores de Expressão 34

35 Características de um vetor de expressão # Vetores de expressão procarióticos Promotores fortes Sítios de ligação a ribossomos Sítios de clonagem # Vetores de expressão eucarióticos rigem de replicação eucariótica Região de controle de transcrição e tradução, poliadenilação de mrna, capping Sinais especiais para processamento e secreção 35

36 Vetores de Transporte Extração e Purificação de DNA 36

37 DNA Ribossomos Flagelo Célula é a unidade da vida Envelope Nuclear Mitocôndria Membrana Plasmática Ribossomos Peroxissomos Citoesqueleto Nucléolo Retículo Endoplasmático Rugoso Lisossomo Vesícula Complexo Golgi REL Núcleo Mitocôndria Cloroplasto Amido Parede Celular Parede Celular Adjacente RER Nucléolo Vacúolo Plasmodesma Núcleo REL Citoesqueleto Ribossomos CG Cromossomo Eucariótico DNA e Proteína s 37

38 H 3 H - 5 P DNA T P A H H P C G P H H P G C P H H P A T P H H P T A P - H 5 H 3 DNA Ribossomos Flagelo Qual é o procedimento a ser adotado para obter-se DNA puro? Envelope Nuclear Mitocôndria Membrana Plasmática Ribossomos Peroxissomos Citoesqueleto Nucléolo Retículo Endoplasmático Rugoso Lisossomo Vesícula Complexo Golgi REL Núcleo Mitocôndria Cloroplasto Amido Parede Celular Parede Celular Adjacente RER Nucléolo Vacúolo Plasmodesma Núcleo REL Citoesqueleto Ribossomos CG 38

39 Extração e Purificação de DNA: ênfase em plantas Diversidade de protocolos Protocolos básicos de purificação de DNA # Dellaporta et al. (1983) # Doyle & Doyle (1987) Protocolos visam sanar... Degradação do DNA por DNases Co-isolamento de polissacarídeos Co-isolamento de compostos fenólicos 39

40 Considerações Gerais Rompimento das paredes celulares Rompimento de membranas celulares - SDS (dodecil sulfato de sódio) - CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio Inibição de enzimas degradativas - ph - EDTA (ác. etileno diamino tetracético)... continua Redução dos efeitos de proteínas - fenol e/ou clorofórmio Eliminação de polissacarídeos - CTAB Precipitação de macromolélucas - NaCl - acetato de sódio e de amônio - álcool (etanol, isopropanol) Emprego de enzimas hidrolíticas Eliminação de compostos fenólicos 40

41 Quantificação e Diluição de DNA Eletroforese em gel de agarose Espectrofotometria Fluorometria Eletroforese Definição - procedimento laboratorial que permite separar moléculas sob a influência de um campo elétrico. Princípio - moléculas com carga + pólo negativo - moléculas com carga - pólo positivo 41

42 Moléculas DNA Fosfato Base nitrogenada Pentose Proteínas Suportes da Eletroforese Papel-filtro Sílica-gel Membranas de Acetato de Celulose Poliacrilamida Géis de amido Géis de agarose 42

43 Aparato de Eletroforese Fonte Cuba Corrida eletroforética: - horizontal - vertical Horizontal Fonte Cuba 43

44 Vertical Eletroforese - mra mrb A B + 44

45 Amostra Catodo Canaletas Tampão Suporte Anodo Tampão Tipos de Eletroforese Eletroforese em gel - Agarose - Poliacrilamida - Desnaturante - Não desnaturante Eletroforese capilar - Em zona - Em gel 45

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50 Rotina Básica: Preparo gel de agarose Corrida eletroforética Revelação dos fragmentos de DNA 50

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59 Imagem capturada no computador 59

60 Estimativa do Tamanho das Moléculas de DNA 60

61 Estimativa do Tamanho das Moléculas de DNA Fórmula: D = a b(log M) D distância percorrida M - peso molecular a e b - constantes que dependem das condições de eletroforese Execução de uma digestão de restrição com enzimas de restrição 61

62 Execução de uma digestão de restrição com enzimas de restrição Execução de uma digestão de restrição com enzimas de restrição 62

63 Mapa de Restrição Mostra as posições de diferentes sítios de restrição em uma molécula de DNA Exercício 1 DNA para um gene tem o seguinte mapa de restrição empregando-se a enzima de restrição BglII: 2,1 kb 2,8 kb 1,2 kb # Quais fragmentos serão gerados se: a) correr uma mutação no primeiro sítio de restrição b) correr uma novo sítio de restrição a 2,7 kb da extremidade esquerda do gene # Faça representação dos fragmentos gerados com base na separação por eletroforese em gel de agarose para os itens a e b 63

64 Exercício 2 Um fragmento linear de DNA é clivado individualmente com as enzimas de restrição HindIII e SmaI e depois com uma combinação das duas enzimas. s fragmentos obtidos são: HindIII SmaI HindIII e SmaI 2.5kb, 5.0kb 2.0kb, 5.5kb 2.5kb, 3.0kb, 2.0kb Assim, apresente o mapa de restrição HIBRIDIZAÇÃ Processo pelo qual fitas simples de DNA com seqüências de bases complementares mantêm-se unidas para formar uma molécula de DNA dupla fita. Sonda molécula de RNA ou DNA fita simples utilizada para detectar a presença de ácidos nucléicos complementares. 64

65 Marcação da Sonda HIBRIDIZAÇÃ 65

66 Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) 94 o C Desnaturação o C Pareamento (anelamento) 72 o C Síntese de nova fita de DNA 66